Heterogeneidade das fibras musculares esqueléticas humanas além da cadeia pesada de miosina

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O músculo esquelético é um tecido heterogêneo composto predominantemente por miofibrilas, que em humanos são tipicamente classificadas em três tipos: um “lento” (tipo 1) e dois “rápidos” (tipos 2A e 2X). No entanto, a heterogeneidade entre e dentro dos tipos tradicionais de miofibrilas permanece pouco compreendida. Aplicamos abordagens transcriptômicas e proteômicas a 1050 e 1038 miofibrilas individuais do músculo vasto lateral humano, respectivamente. O estudo proteômico incluiu homens, e o estudo transcriptômico incluiu 10 homens e 2 mulheres. Além das isoformas da cadeia pesada de miosina, identificamos proteínas metabólicas, proteínas ribossômicas e proteínas de junção celular como fontes de variabilidade intermiofibrilar multidimensional. Além disso, apesar da identificação de agrupamentos de fibras lentas e rápidas, nossos dados sugerem que as fibras do tipo 2X são fenotipicamente indistinguíveis de outras fibras de contração rápida. Além disso, a classificação baseada na cadeia pesada da miosina é insuficiente para descrever o fenótipo das miofibras em miopatias nemalínicas. No geral, nossos dados sugerem uma heterogeneidade multidimensional das miofibras, com fontes de variação que vão além das isoformas da cadeia pesada da miosina.
A heterogeneidade celular é uma característica inerente a todos os sistemas biológicos, permitindo que as células se especializem para atender às diferentes necessidades dos tecidos e das próprias células.¹ A visão tradicional da heterogeneidade das fibras musculares esqueléticas era de que os neurônios motores definiam o tipo de fibra dentro de uma unidade motora e que o tipo de fibra (ou seja, tipo 1, tipo 2A e tipo 2X em humanos) era determinado pelas características das isoformas da cadeia pesada de miosina (MYH).² Inicialmente, isso se baseava na instabilidade da ATPase em função do pH^3,4 e, posteriormente, na expressão molecular da MYH.⁵ No entanto, com a identificação e subsequente aceitação de fibras “mistas” que coexpressam múltiplas MYHs em proporções variáveis, as fibras musculares esqueléticas são cada vez mais vistas como um continuum, em vez de tipos de fibra distintos.⁶ Apesar disso, a área ainda depende fortemente da MYH como o principal classificador para a classificação das miofibras, uma visão provavelmente influenciada pelas limitações e vieses significativos dos primeiros estudos com roedores, cujos perfis de expressão de MYH e gama de tipos de fibra diferem daqueles em humanos.² A situação é ainda mais complicada pelo fato de que que diferentes músculos esqueléticos humanos exibem uma gama diversificada de tipos de fibras.7 O vasto lateral é um músculo misto com um perfil de expressão MYH intermediário (e, portanto, representativo).7 Além disso, a facilidade de amostragem faz dele o músculo mais estudado em humanos.
Assim, a investigação imparcial da diversidade das fibras musculares esqueléticas utilizando ferramentas “ômicas” poderosas é crucial, mas também desafiadora, em parte devido à natureza multinucleada das fibras musculares esqueléticas. No entanto, as tecnologias de transcriptômica8,9 e proteômica10 passaram por uma revolução em sensibilidade nos últimos anos devido a vários avanços tecnológicos, permitindo a análise do músculo esquelético com resolução de fibra única. Como resultado, progressos significativos foram alcançados na caracterização da diversidade de fibras individuais e sua resposta a estímulos atróficos e ao envelhecimento11,12,13,14,15,16,17,18. É importante ressaltar que esses avanços tecnológicos têm aplicações clínicas, permitindo uma caracterização mais detalhada e precisa da desregulação associada a doenças. Por exemplo, a fisiopatologia da miopatia nemalínica, uma das doenças musculares hereditárias mais comuns (MIM 605355 e MIM 161800), é complexa e confusa.19,20 Portanto, uma melhor caracterização da desregulação das fibras musculares esqueléticas poderia levar a avanços significativos em nossa compreensão dessa doença.
Desenvolvemos métodos para análise transcriptômica e proteômica de fibras musculares esqueléticas individuais isoladas manualmente de amostras de biópsia humana e os aplicamos a milhares de fibras, permitindo-nos investigar a heterogeneidade celular das fibras musculares esqueléticas humanas. No decorrer deste trabalho, demonstramos o poder da fenotipagem transcriptômica e proteômica de fibras musculares e identificamos proteínas metabólicas, ribossômicas e de junção celular como fontes significativas de variabilidade interfibras. Além disso, utilizando esse fluxo de trabalho proteômico, caracterizamos a relevância clínica da miopatia por nematóides em fibras musculares esqueléticas individuais, revelando uma mudança coordenada em direção a fibras não oxidativas, independente do tipo de fibra, com base na MYH.
Para investigar a heterogeneidade das fibras musculares esqueléticas humanas, desenvolvemos dois fluxos de trabalho para permitir a análise do transcriptoma e do proteoma de fibras musculares esqueléticas individuais (Figura 1A e Figura Suplementar 1A). Desenvolvemos e otimizamos diversas etapas metodológicas, desde o armazenamento da amostra e a preservação da integridade do RNA e das proteínas até a otimização da produtividade para cada abordagem. Para a análise do transcriptoma, isso foi alcançado pela inserção de códigos de barras moleculares específicos da amostra na etapa inicial da transcrição reversa, permitindo que 96 fibras fossem agrupadas para um processamento subsequente eficiente. O sequenciamento mais profundo (±1 milhão de leituras por fibra), em comparação com as abordagens tradicionais de célula única, enriqueceu ainda mais os dados do transcriptoma.²¹ Para a proteômica, utilizamos um gradiente cromatográfico curto (21 minutos) combinado com a aquisição de dados DIA-PASEF em um espectrômetro de massas timsTOF para otimizar a profundidade do proteoma, mantendo a alta produtividade. 22,23 Para investigar a heterogeneidade das fibras musculares esqueléticas saudáveis, caracterizamos os transcriptomas de 1.050 fibras individuais de 14 doadores adultos saudáveis ​​e os proteomas de 1.038 fibras de 5 doadores adultos saudáveis ​​(Tabela Suplementar 1). Neste artigo, esses conjuntos de dados são denominados transcriptomas e proteomas de 1.000 fibras, respectivamente. Nossa abordagem detectou um total de 27.237 transcritos e 2.983 proteínas nas análises transcriptômicas e proteômicas de 1.000 fibras (Figura 1A, Conjuntos de Dados Suplementares 1–2). Após filtrar os conjuntos de dados transcriptômicos e proteômicos para >1.000 genes detectados e 50% de valores válidos por fibra, análises bioinformáticas subsequentes foram realizadas para 925 e 974 fibras no transcriptoma e proteoma, respectivamente. Após a filtragem, uma média de 4257 ± 1557 genes e 2015 ± 234 proteínas (média ± DP) foram detectadas por fibra, com variabilidade interindividual limitada (Figuras Suplementares 1B–C, Conjuntos de Dados Suplementares 3–4). No entanto, a variabilidade intraindividual foi mais pronunciada entre os participantes, provavelmente devido a diferenças no rendimento de RNA/proteína entre fibras de diferentes comprimentos e áreas de secção transversal. Para a maioria das proteínas (>2000), o coeficiente de variação foi inferior a 20% (Figura Suplementar 1D). Ambos os métodos permitiram capturar uma ampla gama dinâmica de transcritos e proteínas com assinaturas altamente expressas importantes para a contração muscular (por exemplo, ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (Figuras Suplementares 1E–F). A maioria das características identificadas eram comuns entre os conjuntos de dados transcriptômicos e proteômicos (Figura Suplementar 1G), e as intensidades médias de UMI/LFQ dessas características apresentaram uma correlação razoavelmente boa (r = 0,52) (Figura Suplementar 1H).
Fluxograma de transcriptômica e proteômica (criado com BioRender.com). BD Curvas de faixa dinâmica para MYH7, MYH2 e MYH1, e limiares calculados para atribuição do tipo de fibra. E, F Distribuição da expressão de MYH entre as fibras em conjuntos de dados de transcriptômica e proteômica. G, H Gráficos de Aproximação e Projeção de Diversidade Uniforme (UMAP) para transcriptômica e proteômica, coloridos por tipo de fibra baseado em MYH. I, J Gráficos de características mostrando a expressão de MYH7, MYH2 e MYH1 em conjuntos de dados de transcriptômica e proteômica.
Inicialmente, propusemos atribuir o tipo de fibra com base em MYH a cada fibra usando uma abordagem otimizada que aproveita a alta sensibilidade e a faixa dinâmica da expressão de MYH em conjuntos de dados ômicos. Estudos anteriores utilizaram limiares arbitrários para classificar as fibras como tipo 1 puro, tipo 2A, tipo 2X ou mistas, com base em uma porcentagem fixa de expressão de diferentes MYHs11,14,24. Utilizamos uma abordagem diferente, na qual a expressão de cada fibra foi classificada pelos MYHs que usamos para tipificar as fibras: MYH7, MYH2 e MYH1, correspondentes às fibras tipo 1, tipo 2A e tipo 2X, respectivamente. Em seguida, calculamos matematicamente o ponto de inflexão inferior de cada curva resultante e o utilizamos como limiar para classificar as fibras como positivas (acima do limiar) ou negativas (abaixo do limiar) para cada MYH (Figura 1B–D). Esses dados demonstram que MYH7 (Figura 1B) e MYH2 (Figura 1C) apresentam perfis de expressão "ligado/desligado" mais distintos no nível de RNA em comparação com o nível de proteína. De fato, no nível de proteína, pouquíssimas fibras não expressaram MYH7 e nenhuma fibra apresentou 100% de expressão de MYH2. Em seguida, utilizamos limiares de expressão predeterminados para atribuir tipos de fibra baseados em MYH a todas as fibras em cada conjunto de dados. Por exemplo, fibras MYH7+/MYH2-/MYH1- foram atribuídas ao tipo 1, enquanto fibras MYH7-/MYH2+/MYH1+ foram atribuídas ao tipo misto 2A/2X (consulte a Tabela Suplementar 2 para obter uma descrição completa). Ao agrupar todas as fibras, observamos uma distribuição notavelmente semelhante de tipos de fibra baseados em MYH tanto no nível de RNA (Figura 1E) quanto no nível de proteína (Figura 1F), enquanto a composição relativa dos tipos de fibra baseados em MYH variou entre os indivíduos, como esperado (Figura Suplementar 2A). A maioria das fibras foi classificada como tipo 1 puro (34–35%) ou tipo 2A (36–38%), embora um número significativo de fibras mistas tipo 2A/2X também tenha sido detectado (16–19%). Uma diferença notável é que as fibras tipo 2X puras só puderam ser detectadas no nível de RNA, mas não no nível de proteína, sugerindo que a expressão rápida de MYH é, pelo menos em parte, regulada pós-transcricionalmente.
Validamos nosso método de tipagem de fibras MYH baseado em proteômica usando dot blotting com anticorpos, e ambos os métodos alcançaram 100% de concordância na identificação de fibras puras do tipo 1 e do tipo 2A (ver Figura Suplementar 2B). No entanto, a abordagem baseada em proteômica mostrou-se mais sensível e eficiente na identificação de fibras mistas e na quantificação da proporção de cada gene MYH em cada fibra. Esses dados demonstram a eficácia do uso de uma abordagem objetiva e altamente sensível baseada em ômicas para caracterizar os tipos de fibras musculares esqueléticas.
Em seguida, utilizamos as informações combinadas fornecidas pela transcriptômica e proteômica para classificar objetivamente as miofibras com base em seu transcriptoma ou proteoma completo. Usando o método de aproximação e projeção de variedades uniformes (UMAP) para reduzir a dimensionalidade a seis componentes principais (Figuras Suplementares 3A–B), conseguimos visualizar a variabilidade das miofibras no transcriptoma (Figura 1G) e no proteoma (Figura 1H). Notavelmente, as miofibras não foram agrupadas por participantes (Figuras Suplementares 3C–D) ou dias de teste (Figura Suplementar 3E) nos conjuntos de dados de transcriptômica ou proteômica, sugerindo que a variabilidade intraindividual nas fibras musculares esqueléticas é maior do que a variabilidade interindividual. No gráfico UMAP, emergiram dois agrupamentos distintos representando miofibras “rápidas” e “lentas” (Figuras 1G–H). As miofibras MYH7+ (lentas) agruparam-se no polo positivo de UMAP1, enquanto as miofibras MYH2+ e MYH1+ (rápidas) agruparam-se no polo negativo de UMAP1 (Figuras 1I–J). No entanto, não foi possível distinguir entre os tipos de fibras de contração rápida (ou seja, tipo 2A, tipo 2X ou mistas 2A/2X) com base na expressão de MYH, sugerindo que a expressão de MYH1 (Figura 1I–J) ou de outros marcadores clássicos de miofibras 2X, como ACTN3 ou MYLK2 (Figuras Suplementares 4A–B), não diferencia os diferentes tipos de miofibras quando se considera o transcriptoma ou proteoma completo. Além disso, em comparação com MYH2 e MYH7, poucos transcritos ou proteínas apresentaram correlação positiva com MYH1 (Figuras Suplementares 4C–H), sugerindo que a abundância de MYH1 não reflete completamente o transcriptoma/proteoma da miofibra. Conclusões semelhantes foram obtidas ao avaliar a expressão mista das três isoformas de MYH no nível UMAP (Figuras Suplementares 4I–J). Assim, embora as fibras 2X possam ser identificadas no nível de transcrito com base apenas na quantificação de MYH, as fibras MYH1+ não são distinguíveis de outras fibras rápidas quando se considera o transcriptoma ou proteoma completo.
Como uma exploração inicial da heterogeneidade das fibras lentas além de MYH, avaliamos quatro proteínas específicas de tipos de fibras lentas já estabelecidas: TPM3, TNNT1, MYL3 e ATP2A22. Os subtipos de fibras lentas apresentaram correlações de Pearson altas, embora não perfeitas, com MYH7 tanto na transcriptômica (Figura Suplementar 5A) quanto na proteômica (Figura Suplementar 5B). Aproximadamente 25% e 33% das fibras lentas não foram classificadas como fibras lentas puras por todos os subtipos de genes/proteínas na transcriptômica (Figura Suplementar 5C) e na proteômica (Figura Suplementar 5D), respectivamente. Portanto, a classificação de fibras lentas com base em múltiplos subtipos de genes/proteínas introduz complexidade adicional, mesmo para proteínas conhecidas por serem específicas de tipos de fibras. Isso sugere que a classificação de fibras com base em isoformas de uma única família de genes/proteínas pode não refletir adequadamente a verdadeira heterogeneidade das fibras musculares esqueléticas.
Para explorar ainda mais a variabilidade fenotípica das fibras musculares esqueléticas humanas na escala de todo o modelo ômico, realizamos uma redução de dimensionalidade não enviesada dos dados usando análise de componentes principais (PCA) (Figura 2A). De forma semelhante aos gráficos UMAP, nem o participante nem o dia do teste influenciaram o agrupamento das fibras no nível da PCA (Figuras Suplementares 6A–C). Em ambos os conjuntos de dados, o tipo de fibra baseado em MYH foi explicado pelo PC2, que apresentou um agrupamento de fibras de contração lenta do tipo 1 e um segundo agrupamento contendo fibras de contração rápida do tipo 2A, do tipo 2X e fibras mistas 2A/2X (Figura 2A). Em ambos os conjuntos de dados, esses dois agrupamentos foram conectados por um pequeno número de fibras mistas do tipo 1/2A. Como esperado, a análise de sobrerrepresentação dos principais componentes principais confirmou que o PC2 foi impulsionado por assinaturas contráteis e metabólicas (Figura 2B e Figuras Suplementares 6D–E, Conjuntos de Dados Suplementares 5–6). De forma geral, o tipo de fibra baseado em MYH mostrou-se suficiente para explicar a variação contínua ao longo do PC2, com exceção das chamadas fibras 2X, que estavam distribuídas por todo o transcriptoma dentro do cluster rápido.
A. Gráficos de análise de componentes principais (PCA) de conjuntos de dados de transcriptoma e proteoma coloridos de acordo com o tipo de fibra com base em MYH. B. Análise de enriquecimento de transcritos e proteínas condutoras em PC2 e PC1. A análise estatística foi realizada usando o pacote clusterProfiler e valores p ajustados por Benjamini-Hochberg. C, D. Gráficos de PCA coloridos de acordo com os termos de ontologia gênica (GO) de adesão intercelular no transcriptoma e os termos de GO de costâmeros no proteoma. As setas representam os transcritos e proteínas condutoras e suas direções. E, F. Gráficos de características de aproximação e projeção de variedades uniformes (UMAP) de características clinicamente relevantes mostrando gradientes de expressão independentes do tipo de fibra lenta/rápida. G, H. Correlações entre os condutores de PC2 e PC1 em transcriptomas e proteomas.
Inesperadamente, o tipo de fibra muscular baseado em MYH explicou apenas o segundo maior grau de variabilidade (PC2), sugerindo que outros fatores biológicos não relacionados ao tipo de fibra muscular baseado em MYH (PC1) desempenham um papel importante na regulação da heterogeneidade das fibras musculares esqueléticas. A análise de sobrerrepresentação dos principais fatores determinantes em PC1 revelou que a variabilidade em PC1 foi determinada principalmente pela adesão célula-célula e pelo conteúdo de ribossomos no transcriptoma, e pelos costâmeros e proteínas ribossômicas no proteoma (Figura 2B e Figuras Suplementares 6D–E, Conjunto de Dados Suplementares 7). No músculo esquelético, os costâmeros conectam o disco Z ao sarcolema e estão envolvidos na transmissão de força e na sinalização.²⁵ Gráficos de PCA anotados usando características de adesão célula-célula (transcriptoma, Figura 2C) e costâmeros (proteoma, Figura 2D) revelaram um forte deslocamento para a esquerda em PC1, indicando que essas características são enriquecidas em certas fibras.
Uma análise mais detalhada do agrupamento de miofibras no nível UMAP revelou que a maioria das características exibia um gradiente de expressão baseado em MYH independente do tipo de miofibra, em vez de ser específico para subgrupos de miofibras. Essa continuidade foi observada para diversos genes associados a condições patológicas (Figura 2E), como CHCHD10 (doença neuromuscular), SLIT3 (atrofia muscular) e CTDNEP1 (doença muscular). Essa continuidade também foi observada em todo o proteoma, incluindo proteínas associadas a distúrbios neurológicos (UGDH), sinalização da insulina (PHIP) e transcrição (HIST1H2AB) (Figura 2F). Em conjunto, esses dados indicam continuidade na heterogeneidade de contração lenta/rápida independente do tipo de fibra em diferentes miofibras.
Curiosamente, os genes condutores no PC2 apresentaram boa correlação transcriptoma-proteoma (r = 0,663) (Figura 2G), sugerindo que os tipos de fibras de contração lenta e rápida, e em particular as propriedades contráteis e metabólicas das fibras musculares esqueléticas, são regulados transcricionalmente. No entanto, os genes condutores no PC1 não apresentaram correlação transcriptoma-proteoma (r = -0,027) (Figura 2H), sugerindo que as variações não relacionadas aos tipos de fibras de contração lenta/rápida são em grande parte reguladas pós-transcricionalmente. Como as variações no PC1 foram explicadas principalmente por termos de ontologia de genes ribossômicos, e dado que os ribossomos desempenham um papel crucial e especializado na célula, participando ativamente e influenciando a tradução de proteínas,31 em seguida, investigamos essa heterogeneidade ribossômica inesperada.
Inicialmente, colorimos o gráfico de análise de componentes principais da proteômica de acordo com a abundância relativa de proteínas no termo GOCC “ribossomo citoplasmático” (Figura 3A). Embora esse termo esteja enriquecido no lado positivo do PC1, resultando em um pequeno gradiente, as proteínas ribossômicas impulsionam a partição em ambas as direções do PC1 (Figura 3A). As proteínas ribossômicas enriquecidas no lado negativo do PC1 incluíram RPL18, RPS18 e RPS13 (Figura 3B), enquanto RPL31, RPL35 e RPL38 (Figura 3C) foram os principais impulsionadores no lado positivo do PC1. Curiosamente, RPL38 e RPS13 apresentaram alta expressão no músculo esquelético em comparação com outros tecidos (Figura Suplementar 7A). Essas assinaturas ribossômicas distintas no PC1 não foram observadas no transcriptoma (Figura Suplementar 7B), indicando regulação pós-transcricional.
A. Gráfico de análise de componentes principais (PCA) colorido de acordo com os termos da ontologia gênica (GO) de proteínas ribossômicas citoplasmáticas em todo o proteoma. As setas indicam a direção da variação mediada por proteínas no gráfico de PCA. O comprimento da linha corresponde à pontuação do componente principal para uma determinada proteína. B, C. Gráficos de características de PCA para RPS13 e RPL38. D. Análise de agrupamento hierárquico não supervisionado de proteínas ribossômicas citoplasmáticas. E. Modelo estrutural do ribossomo 80S (PDB: 4V6X) destacando proteínas ribossômicas com diferentes abundâncias em fibras musculares esqueléticas. F. Proteínas ribossômicas com diferentes estequiometrias localizadas próximas ao canal de saída do mRNA.
Os conceitos de heterogeneidade e especialização ribossômica já foram propostos anteriormente, segundo os quais a presença de subpopulações distintas de ribossomos (heterogeneidade ribossômica) pode influenciar diretamente a tradução de proteínas em diferentes tecidos32 e células33 por meio da tradução seletiva de conjuntos específicos de transcritos de mRNA34 (especialização ribossômica). Para identificar subpopulações de proteínas ribossômicas coexpressas em fibras musculares esqueléticas, realizamos uma análise de agrupamento hierárquico não supervisionado de proteínas ribossômicas no proteoma (Figura 3D, Conjunto de Dados Suplementares 8). Como esperado, as proteínas ribossômicas não se agruparam por tipo de fibra com base em MYH. No entanto, identificamos três grupos distintos de proteínas ribossômicas; o primeiro grupo (ribosomal_cluster_1) é co-regulado com RPL38 e, portanto, apresenta expressão aumentada em fibras com perfil PC1 positivo. O segundo grupo (ribosomal_cluster_2) é co-regulado com RPS13 e apresenta expressão elevada em fibras com perfil PC1 negativo. O terceiro agrupamento (ribosomal_cluster_3) não apresenta expressão diferencial coordenada nas fibras musculares esqueléticas e pode ser considerado a proteína ribossômica “central” do músculo esquelético. Os agrupamentos ribossômicos 1 e 2 contêm proteínas ribossômicas que já demonstraram regular a tradução alternativa (por exemplo, RPL10A, RPL38, RPS19 e RPS25) e influenciar funcionalmente o desenvolvimento (por exemplo, RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 De acordo com os resultados da PCA, a representação heterogênea observada dessas proteínas ribossômicas entre as fibras também apresentou continuidade (Figura Suplementar 7C).
Para visualizar a localização de proteínas ribossômicas heterogêneas dentro do ribossomo, utilizamos um modelo estrutural do ribossomo 80S humano (Protein Data Bank: 4V6X) (Figura 3E). Após isolar proteínas ribossômicas pertencentes a diferentes agrupamentos ribossômicos, suas localizações não estavam alinhadas de forma precisa, sugerindo que nossa abordagem não conseguiu fornecer enriquecimento para certas regiões/frações do ribossomo. Curiosamente, no entanto, a proporção de proteínas da subunidade maior no agrupamento 2 foi menor do que nos agrupamentos 1 e 3 (Figura Suplementar 7D). Observamos que proteínas com estequiometria alterada em fibras musculares esqueléticas estavam predominantemente localizadas na superfície do ribossomo (Figura 3E), o que é consistente com sua capacidade de interagir com elementos de entrada interna do ribossomo (IRES) em diferentes populações de mRNA, coordenando assim a tradução seletiva. 40, 41 Além disso, muitas proteínas com estequiometria alterada em fibras musculares esqueléticas estavam localizadas perto de regiões funcionais, como o túnel de saída do mRNA (Figura 3F), que regulam seletivamente o alongamento e a interrupção da tradução de peptídeos específicos. 42 Em resumo, nossos dados sugerem que a estequiometria das proteínas ribossômicas do músculo esquelético apresenta heterogeneidade, resultando em diferenças entre as fibras musculares esqueléticas.
Em seguida, buscamos identificar assinaturas de fibras musculares de contração rápida e lenta e explorar os mecanismos de sua regulação transcricional. Comparando os agrupamentos de fibras de contração rápida e lenta definidos por UMAP nos dois conjuntos de dados (Figuras 1G–H e 4A–B), as análises transcriptômicas e proteômicas identificaram 1366 e 804 características com abundância diferencial, respectivamente (Figuras 4A–B, Conjuntos de Dados Suplementares 9–12). Observamos as diferenças esperadas em assinaturas relacionadas a sarcômeros (por exemplo, tropomiosina e troponina), acoplamento excitação-contração (isoformas de SERCA) e metabolismo energético (por exemplo, ALDOA e CKB). Além disso, transcritos e proteínas que regulam a ubiquitinação de proteínas apresentaram expressão diferencial em fibras de contração rápida e lenta (por exemplo, USP54, SH3RF2, USP28 e USP48) (Figuras 4A–B). Além disso, o gene da proteína microbiana RP11-451G4.2 (DWORF), que já havia demonstrado expressão diferencial entre os diferentes tipos de fibras musculares de cordeiro43 e que aumenta a atividade da SERCA no músculo cardíaco44, apresentou regulação positiva significativa nas fibras musculares esqueléticas de contração lenta (Figura 4A). De forma semelhante, em nível de fibra individual, foram observadas diferenças significativas em marcadores conhecidos, como as isoformas da lactato desidrogenase relacionadas ao metabolismo (LDHA e LDHB, Figura 4C e Figura Suplementar 8A)45,46, bem como em marcadores específicos de tipo de fibra previamente desconhecidos (como IRX3, USP54, USP28 e DPYSL3) (Figura 4C). Houve uma sobreposição significativa de características com expressão diferencial entre os conjuntos de dados transcriptômicos e proteômicos (Figura Suplementar 8B), bem como uma correlação de variação de expressão gênica impulsionada principalmente pela expressão diferencial mais pronunciada das características do sarcômero (Figura Suplementar 8C). Notavelmente, algumas assinaturas (por exemplo, USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) mostraram forte regulação pós-transcricional apenas no nível proteômico e apresentaram perfis de expressão específicos para o tipo de fibra de contração lenta/rápida (Figura Suplementar 8C).
A e B: Gráficos de vulcão comparando os clusters lentos e rápidos identificados pelos gráficos de aproximação e projeção de variedade uniforme (UMAP) nas Figuras 1G–H. Os pontos coloridos representam transcritos ou proteínas que são significativamente diferentes com FDR < 0,05, e os pontos mais escuros representam transcritos ou proteínas que são significativamente diferentes com log change > 1. A análise estatística bidirecional foi realizada usando o teste de Wald do DESeq2 com valores p ajustados por Benjamini-Hochberg (transcriptômica) ou o método do modelo linear Limma com análise Bayesiana empírica seguida de ajuste de Benjamini-Hochberg para comparações múltiplas (proteômica). C: Gráficos de assinatura de genes ou proteínas selecionados com expressão diferencial entre fibras lentas e rápidas. D: Análise de enriquecimento de transcritos e proteínas com expressão diferencial significativa. Valores sobrepostos são enriquecidos em ambos os conjuntos de dados, valores do transcriptoma são enriquecidos apenas no transcriptoma e valores do proteoma são enriquecidos apenas no proteoma. A análise estatística foi realizada utilizando o pacote clusterProfiler com valores p ajustados por Benjamini-Hochberg. E. Fatores de transcrição específicos do tipo de fibra identificados pelo SCENIC com base em escores de especificidade de reguladores derivados do SCENIC e expressão diferencial de mRNA entre os tipos de fibra. F. Perfil de fatores de transcrição selecionados com expressão diferencial entre fibras lentas e rápidas.
Em seguida, realizamos uma análise de sobrerrepresentação de genes e proteínas diferencialmente representados (Figura 4D, Conjunto de Dados Suplementares 13). O enriquecimento de vias para características que diferiram entre os dois conjuntos de dados revelou diferenças esperadas, como processos de β-oxidação de ácidos graxos e metabolismo de cetonas (fibras lentas), contração de miofilamentos/músculos (fibras rápidas e lentas, respectivamente) e processos catabólicos de carboidratos (fibras rápidas). A atividade da fosfatase de serina/treonina também estava elevada em fibras rápidas, impulsionada por características como as subunidades regulatórias e catalíticas da fosfatase (PPP3CB, PPP1R3D e PPP1R3A), que são conhecidas por regular o metabolismo do glicogênio (47) (Figuras Suplementares 8D–E). Outras vias enriquecidas em fibras rápidas incluíram corpos de processamento (P-) (YTHDF3, TRIM21, LSM2) no proteoma (Figura Suplementar 8F), potencialmente envolvidos na regulação pós-transcricional (48), e atividade de fator de transcrição (SREBF1, RXRG, RORA) no transcriptoma (Figura Suplementar 8G). As fibras lentas foram enriquecidas em atividade de oxidorredutase (BDH1, DCXR, TXN2) (Figura Suplementar 8H), ligação de amida (CPTP, PFDN2, CRYAB) (Figura Suplementar 8I), matriz extracelular (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (Figura Suplementar 8J) e atividade de receptor-ligante (FNDC5, SPX, NENF) (Figura Suplementar 8K).
Para obter uma compreensão mais aprofundada da regulação transcricional subjacente às características dos tipos de fibras musculares lentas/rápidas, realizamos uma análise de enriquecimento de fatores de transcrição utilizando o SCENIC49 (Conjunto de Dados Suplementares 14). Muitos fatores de transcrição apresentaram enriquecimento significativo entre as fibras musculares rápidas e lentas (Figura 4E). Isso incluiu fatores de transcrição como MAFA, que já foi associado ao desenvolvimento de fibras musculares rápidas,⁵⁰ bem como diversos fatores de transcrição não previamente associados a programas genéticos específicos de tipos de fibras musculares. Entre esses, PITX1, EGR1 e MYF6 foram os fatores de transcrição mais enriquecidos em fibras musculares rápidas (Figura 4E). Em contraste, ZSCAN30 e EPAS1 (também conhecido como HIF2A) foram os fatores de transcrição mais enriquecidos em fibras musculares lentas (Figura 4E). De forma consistente, MAFA apresentou níveis de expressão mais elevados na região UMAP correspondente às fibras musculares rápidas, enquanto EPAS1 apresentou o padrão de expressão oposto (Figura 4F).
Além dos genes codificadores de proteínas conhecidos, existem inúmeros biótipos de RNA não codificadores que podem estar envolvidos na regulação do desenvolvimento humano e de doenças. 51, 52 Em conjuntos de dados de transcriptoma, vários RNAs não codificadores exibem especificidade de tipo de fibra (Figura 5A e Conjunto de Dados Suplementar 15), incluindo o LINC01405, que é altamente específico para fibras lentas e cuja expressão é relatada como reduzida em músculos de pacientes com miopatia mitocondrial. 53 Em contraste, o RP11-255P5.3, correspondente ao gene lnc-ERCC5-5 (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54, exibe especificidade de tipo de fibra rápida. Tanto LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) quanto RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) exibem especificidade para músculo esquelético (Figuras Suplementares 9A–B) e não possuem genes contráteis conhecidos em sua vizinhança genômica de 1 Mb, sugerindo que desempenham um papel especializado na regulação dos tipos de fibra, em vez de regular genes contráteis vizinhos. Os perfis de expressão específicos para os tipos de fibra lenta/rápida de LINC01405 e RP11-255P5.3, respectivamente, foram confirmados usando RNAscope (Figuras 5B–C).
A. Transcritos de RNA não codificante são significativamente regulados em fibras musculares de contração lenta e rápida. B. Imagens representativas de RNAscope mostrando a especificidade do tipo de fibra de contração lenta e rápida de LINC01405 e RP11-255P5.3, respectivamente. Barra de escala = 50 μm. C. Quantificação da expressão de RNA não codificante específica do tipo de fibra muscular, determinada por RNAscope (n = 3 biópsias de indivíduos independentes, comparando fibras musculares rápidas e lentas em cada indivíduo). A análise estatística foi realizada utilizando o teste t de Student bicaudal. Os diagramas de caixa mostram a mediana e o primeiro e terceiro quartis, com as linhas indicando os valores mínimo e máximo. D. Fluxograma de identificação de proteínas microbianas de novo (criado com BioRender.com). E. A proteína microbiana LINC01405_ORF408:17441:17358 é expressa especificamente em fibras musculares esqueléticas de contração lenta (n=5 biópsias de participantes independentes, comparando fibras musculares rápidas e lentas em cada participante). A análise estatística foi realizada utilizando o método do modelo linear Limm combinado com uma abordagem Bayesiana empírica, seguida pelo método de Benjamini-Hochberg para comparações múltiplas com ajuste do valor p. Os diagramas de caixa mostram a mediana, o primeiro e o terceiro quartis, com as linhas indicando os valores máximo e mínimo.
Estudos recentes demonstraram que muitos transcritos não codificantes putativos codificam proteínas microbianas transcritas, algumas das quais regulam a função muscular.^{44, 55} Para identificar proteínas microbianas com potencial especificidade para o tipo de fibra, pesquisamos nosso conjunto de dados de proteoma de 1000 fibras usando um arquivo FASTA personalizado contendo as sequências de transcritos não codificantes (n = 305) encontrados no conjunto de dados de transcriptoma de 1000 fibras (Figura 5D). Identificamos 197 proteínas microbianas a partir de 22 transcritos diferentes, 71 das quais apresentaram regulação diferencial entre fibras musculares esqueléticas lentas e rápidas (Figura Suplementar 9C e Conjunto de Dados Suplementares 16). Para LINC01405, três produtos proteicos microbianos foram identificados, um dos quais apresentou especificidade semelhante para fibras lentas ao seu transcrito (Figura 5E e Figura Suplementar 9D). Assim, identificamos LINC01405 como um gene que codifica uma proteína microbiana específica para fibras musculares esqueléticas lentas.
Desenvolvemos um fluxo de trabalho abrangente para a caracterização proteômica em larga escala de fibras musculares individuais e identificamos reguladores da heterogeneidade das fibras em estados saudáveis. Aplicamos esse fluxo de trabalho para entender como as miopatias nemalínicas afetam a heterogeneidade das fibras musculares esqueléticas. As miopatias nemalínicas são doenças musculares hereditárias que causam fraqueza muscular e, em crianças afetadas, apresentam uma série de complicações, incluindo insuficiência respiratória, escoliose e mobilidade limitada dos membros.^19,20 Tipicamente, nas miopatias nemalínicas, variantes patogênicas em genes como o da actina alfa 1 (ACTA1) resultam em uma predominância de fibras musculares de contração lenta, embora esse efeito seja heterogêneo. Uma exceção notável é a miopatia nemalínica da troponina T1 (TNNT1), que apresenta predominância de fibras rápidas. Assim, uma melhor compreensão da heterogeneidade subjacente à desregulação das fibras musculares esqueléticas observada nas miopatias nemalínicas pode ajudar a desvendar a complexa relação entre essas doenças e o tipo de fibra muscular.
Em comparação com controles saudáveis ​​(n=3 por grupo), as miofibras isoladas de pacientes com miopatia nemalínica com mutações nos genes ACTA1 e TNNT1 apresentaram atrofia ou distrofia acentuada (Figura 6A, Tabela Suplementar 3). Isso representou um desafio técnico significativo para a análise proteômica devido à quantidade limitada de material disponível. Apesar disso, conseguimos detectar 2485 proteínas em 272 miofibras esqueléticas. Após a filtragem para pelo menos 1000 proteínas quantificadas por fibra, 250 fibras foram submetidas à análise bioinformática subsequente. Após a filtragem, uma média de 1573 ± 359 proteínas por fibra foram quantificadas (Figura Suplementar 10A, Conjuntos de Dados Suplementares 17–18). Notavelmente, apesar da redução significativa no tamanho das fibras, a profundidade do proteoma das amostras de pacientes com miopatia nemalínica foi reduzida apenas modestamente. Além disso, o processamento desses dados usando nossos próprios arquivos FASTA (incluindo transcrições não codificantes) nos permitiu identificar cinco proteínas microbianas em miofibras esqueléticas de pacientes com miopatia nemalínica (Conjunto de Dados Suplementares 19). A faixa dinâmica do proteoma foi significativamente mais ampla, e as proteínas totais no grupo controle correlacionaram-se bem com os resultados de uma análise proteômica anterior de 1000 fibras (Figura Suplementar 10B–C).
A. Imagens microscópicas mostrando atrofia ou distrofia de fibras e a predominância de diferentes tipos de fibras com base na MYH em miopatias nemalínicas ACTA1 e TNNT1 (NM). Barra de escala = 100 μm. Para garantir a reprodutibilidade da coloração em pacientes com ACTA1 e TNNT1, três biópsias de pacientes foram coradas de duas a três vezes (quatro seções por caso) antes da seleção de imagens representativas. B. Proporções de tipos de fibras nos participantes com base na MYH. C. Gráfico de análise de componentes principais (PCA) de fibras musculares esqueléticas em pacientes com miopatias nemalínicas e controles. D. Fibras musculares esqueléticas de pacientes com miopatias nemalínicas e controles projetadas em um gráfico de PCA determinado a partir das 1000 fibras analisadas na Figura 2. Por exemplo, gráficos de vulcão comparando as diferenças entre participantes com miopatias nemalínicas ACTA1 e TNNT1 e controles, e entre participantes com miopatias nemalínicas ACTA1 e TNNT1. Os círculos coloridos representam proteínas que apresentaram diferença significativa com π < 0,05, e os pontos escuros representam proteínas que apresentaram diferença significativa com FDR < 0,05. A análise estatística foi realizada utilizando o método do modelo linear Limma e métodos Bayesianos empíricos, seguidos pelo ajuste do valor p para comparações múltiplas utilizando o método de Benjamini-Hochberg. H. Análise de enriquecimento de proteínas com expressão diferencial significativa em todo o proteoma e nas fibras tipo 1 e 2A. A análise estatística foi realizada utilizando o pacote clusterProfiler e valores p ajustados por Benjamini-Hochberg. I, J. Gráficos de análise de componentes principais (PCA) coloridos por termos de ontologia gênica (GO) da matriz extracelular e mitocondrial.
Como as miopatias nemalínicas podem influenciar a proporção de tipos de miofibras que expressam MYH no músculo esquelético,19,20 examinamos inicialmente os tipos de miofibras que expressam MYH em pacientes com miopatias nemalínicas e em controles. Determinamos o tipo de miofibra usando um método imparcial previamente descrito para o ensaio de 1000 miofibras (Figuras Suplementares 10D–E) e, novamente, não conseguimos identificar miofibras 2X puras (Figura 6B). Observamos um efeito heterogêneo das miopatias nemalínicas no tipo de miofibra, visto que dois pacientes com mutações no gene ACTA1 apresentaram uma proporção aumentada de miofibras do tipo 1, enquanto dois pacientes com miopatia nemalínica associada ao gene TNNT1 apresentaram uma proporção reduzida de miofibras do tipo 1 (Figura 6B). De fato, a expressão de MYH2 e das isoformas rápidas de troponina (TNNC2, TNNI2 e TNNT3) estava diminuída nas miopatias nemalínicas ACTA1, enquanto a expressão de MYH7 estava diminuída nas miopatias nemalínicas TNNT1 (Figura Suplementar 11A). Isso está de acordo com relatos anteriores de alternância heterogênea do tipo de fibra muscular em miopatias nemalínicas.19,20 Confirmamos esses resultados por imuno-histoquímica e descobrimos que pacientes com miopatia nemalínica ACTA1 apresentavam predominância de fibras musculares do tipo 1, enquanto pacientes com miopatia nemalínica TNNT1 apresentavam o padrão oposto (Figura 6A).
Em nível de proteoma de fibra única, as fibras musculares esqueléticas de pacientes com miopatia nemalínica ACTA1 e TNNT1 agruparam-se com a maioria das fibras de controle, sendo as fibras de pacientes com miopatia nemalínica TNNT1 geralmente as mais afetadas (Figura 6C). Isso ficou particularmente evidente ao plotar os gráficos de análise de componentes principais (PCA) das fibras pseudo-infladas para cada paciente, com os pacientes 2 e 3 com miopatia nemalínica TNNT1 apresentando-se mais distantes das amostras de controle (Figura Suplementar 11B, Conjunto de Dados Suplementares 20). Para melhor compreender como as fibras de pacientes com miopatia se comparam às fibras saudáveis, utilizamos informações detalhadas obtidas a partir da análise proteômica de 1.000 fibras de participantes adultos saudáveis. Projetamos as fibras do conjunto de dados de miopatia (pacientes com miopatia nemalínica ACTA1 e TNNT1 e controles) no gráfico de PCA obtido a partir da análise proteômica das 1.000 fibras (Figura 6D). A distribuição dos tipos de fibras MYH ao longo do PC2 em fibras controle foi semelhante à distribuição de fibras obtida na análise proteômica de 1000 fibras. No entanto, a maioria das fibras em pacientes com miopatia nemalínica apresentou um deslocamento para baixo no PC2, sobrepondo-se às fibras de contração rápida saudáveis, independentemente do seu tipo de fibra MYH nativo. Assim, embora pacientes com miopatia nemalínica ACTA1 tenham apresentado um deslocamento em direção a fibras do tipo 1 quando quantificados por métodos baseados em MYH, tanto a miopatia nemalínica ACTA1 quanto a miopatia nemalínica TNNT1 deslocaram o proteoma das fibras musculares esqueléticas em direção a fibras de contração rápida.
Em seguida, comparamos diretamente cada grupo de pacientes com controles saudáveis ​​e identificamos 256 e 552 proteínas com expressão diferencial nas miopatias nemalínicas ACTA1 e TNNT1, respectivamente (Figura 6E–G e Figura Suplementar 11C, Conjunto de Dados Suplementares 21). A análise de enriquecimento gênico revelou uma diminuição coordenada nas proteínas mitocondriais (Figura 6H–I, Conjunto de Dados Suplementares 22). Surpreendentemente, apesar da predominância diferencial dos tipos de fibra nas miopatias nemalínicas ACTA1 e TNNT1, essa diminuição foi completamente independente do tipo de fibra baseado em MYH (Figura 6H e Figuras Suplementares 11D–I, Conjunto de Dados Suplementares 23). Três proteínas microbianas também foram reguladas nas miopatias nemalínicas ACTA1 ou TNNT1. Duas dessas microproteínas, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (também conhecida como LINC00598 ou Lnc-FOXO1) e ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), apresentaram abundância diferencial apenas nas miofibras do tipo 1. Já foi relatado que ENSG00000215483_TR14_ORF67 desempenha um papel na regulação do ciclo celular.⁵⁶ Por outro lado, ENSG00000232046_TR1_ORF437 (correspondente a LINC01798) apresentou aumento tanto nas miofibras do tipo 1 quanto nas do tipo 2A na miopatia ACTA1-nemalina em comparação com controles saudáveis ​​(Figura Suplementar 12A, Conjunto de Dados Suplementares 24). Em contraste, as proteínas ribossômicas não foram afetadas em grande parte pela miopatia nemalínica, embora a RPS17 tenha sido regulada negativamente na miopatia nemalínica ACTA1 (Fig. 6E).
A análise de enriquecimento também revelou a regulação positiva de processos do sistema imunológico nas miopatias nemalínicas ACTA1 e TNNT1, enquanto a adesão celular também estava aumentada na miopatia nemalínica TNNT1 (Figura 6H). O enriquecimento desses fatores extracelulares foi refletido pelo deslocamento das proteínas da matriz extracelular no PC1 e PC2 em uma direção negativa (ou seja, em direção às fibras mais afetadas) (Figura 6J). Ambos os grupos de pacientes apresentaram aumento na expressão de proteínas extracelulares envolvidas em respostas imunes e mecanismos de reparo do sarcolema, como as anexinas (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 e sua proteína de interação S100A11159 (Figuras Suplementares 12B–C). Esse processo já foi relatado como aumentado em distrofias musculares60, mas, até onde sabemos, não havia sido associado anteriormente a miopatias nemalínicas. O funcionamento normal dessa maquinaria molecular é necessário para o reparo do sarcolema após lesão e para a fusão de miócitos recém-formados com miofibras58,61. Assim, o aumento da atividade desse processo em ambos os grupos de pacientes sugere uma resposta reparadora à lesão causada pela instabilidade das miofibras.
Os efeitos de cada miopatia nemalínica apresentaram boa correlação (r = 0,736) e sobreposição razoável (Figuras Suplementares 11A–B), indicando que as miopatias nemalínicas ACTA1 e TNNT1 têm efeitos semelhantes no proteoma. No entanto, algumas proteínas foram reguladas apenas nas miopatias nemalínicas ACTA1 ou TNNT1 (Figuras Suplementares 11A e C). A proteína profibrótica MFAP4 foi uma das proteínas mais superexpressas na miopatia nemalínica TNNT1, mas permaneceu inalterada na miopatia nemalínica ACTA1. SKIC8, um componente do complexo PAF1C responsável pela regulação da transcrição do gene HOX, apresentou expressão reduzida na miopatia nemalínica TNNT1, mas não foi afetado na miopatia nemalínica ACTA1 (Figura Suplementar 11A). A comparação direta entre a miopatia nemalínica associada a ACTA1 e a TNNT1 revelou maiores reduções nas proteínas mitocondriais e aumentos nas proteínas do sistema imunológico na miopatia nemalínica associada a TNNT1 (Figura 6G–H e Figuras Suplementares 11C e 11H–I). Esses dados são consistentes com a maior atrofia/distrofia observada na miopatia nemalínica associada a TNNT1 em comparação com a miopatia nemalínica associada a TNNT1 (Figura 6A), sugerindo que a miopatia nemalínica associada a TNNT1 representa uma forma mais grave da doença.
Para avaliar se os efeitos observados da miopatia nemalínica persistem em nível muscular global, realizamos uma análise proteômica em massa de biópsias musculares da mesma coorte de pacientes com miopatia nemalínica TNNT1 e as comparamos com controles (n=3 por grupo) (Figura Suplementar 13A, Conjunto de Dados Suplementares 25). Como esperado, os controles apresentaram alta similaridade na análise de componentes principais, enquanto os pacientes com miopatia nemalínica TNNT1 exibiram maior variabilidade entre as amostras, semelhante à observada na análise de fibras individuais (Figura Suplementar 13B). A análise em massa reproduziu as proteínas diferencialmente expressas (Figura Suplementar 13C, Conjunto de Dados Suplementares 26) e os processos biológicos (Figura Suplementar 13D, Conjunto de Dados Suplementares 27) destacados pela comparação de fibras individuais, mas perdeu a capacidade de distinguir entre diferentes tipos de fibras e não conseguiu explicar os efeitos heterogêneos da doença entre as fibras.
Em conjunto, esses dados demonstram que a proteômica de fibras musculares individuais pode elucidar características biológicas clínicas que não são detectáveis ​​por métodos direcionados, como o immunoblotting. Além disso, esses dados destacam as limitações do uso isolado da tipagem de fibras de actina (MYH) para descrever a adaptação fenotípica. De fato, embora a troca de tipo de fibra difira entre as miopatias nemalínicas de actina e de troponina, ambas as miopatias nemalínicas dissociam a tipagem de fibras MYH do metabolismo da fibra muscular esquelética, resultando em um proteoma muscular mais rápido e menos oxidativo.
A heterogeneidade celular é crucial para que os tecidos atendam às suas diversas demandas. No músculo esquelético, isso é frequentemente descrito como tipos de fibras caracterizados por diferentes graus de produção de força e fatigabilidade. No entanto, é evidente que isso explica apenas uma pequena parte da variabilidade das fibras musculares esqueléticas, que é muito mais variável, complexa e multifacetada do que se pensava anteriormente. Os avanços tecnológicos lançaram luz sobre os fatores que regulam as fibras musculares esqueléticas. De fato, nossos dados sugerem que as fibras do tipo 2X podem não ser um subtipo distinto de fibra muscular esquelética. Além disso, identificamos proteínas metabólicas, proteínas ribossômicas e proteínas associadas à célula como principais determinantes da heterogeneidade das fibras musculares esqueléticas. Ao aplicar nosso fluxo de trabalho proteômico a amostras de pacientes com miopatia por nematóides, demonstramos ainda que a tipagem de fibras baseada em MYH não reflete completamente a heterogeneidade do músculo esquelético, especialmente quando o sistema está perturbado. De fato, independentemente do tipo de fibra baseado em MYH, a miopatia por nematóides resulta em uma mudança para fibras mais rápidas e menos oxidativas.
As fibras musculares esqueléticas são classificadas desde o século XIX. Análises ômicas recentes permitiram começar a compreender os perfis de expressão de diferentes tipos de fibras MYH e suas respostas a diferentes estímulos. Como descrito aqui, as abordagens ômicas também têm a vantagem de maior sensibilidade para quantificar marcadores de tipo de fibra do que os métodos tradicionais baseados em anticorpos, sem depender da quantificação de um único (ou poucos) marcador para definir um tipo de fibra muscular esquelética. Utilizamos fluxos de trabalho transcriptômicos e proteômicos complementares e integramos os resultados para examinar a regulação transcricional e pós-transcricional da heterogeneidade das fibras musculares esqueléticas humanas. Esse fluxo de trabalho resultou na falha em identificar fibras puras do tipo 2X em nível proteico no músculo vasto lateral de nossa coorte de homens jovens saudáveis. Isso está de acordo com estudos anteriores de fibra única que encontraram <1% de fibras puras do tipo 2X em músculos vasto lateral saudáveis, embora isso deva ser confirmado em outros músculos no futuro. A discrepância entre a detecção de fibras 2X quase puras em nível de mRNA e apenas fibras mistas 2A/2X em nível proteico é intrigante. A expressão de mRNA das isoformas de MYH não é circadiana,⁶⁷ sugerindo que é improvável que tenhamos “perdido” o sinal de início da MYH2 em fibras 2X aparentemente puras em nível de RNA. Uma possível explicação, embora puramente hipotética, poderia ser a diferença na estabilidade da proteína e/ou do mRNA entre as isoformas de MYH. De fato, nenhuma fibra rápida é 100% pura para qualquer isoforma de MYH, e não está claro se os níveis de expressão de mRNA da MYH1 na faixa de 70–90% resultariam em abundância igual de MYH1 e MYH2 em nível proteico. No entanto, ao considerar todo o transcriptoma ou proteoma, a análise de agrupamento pode identificar com segurança apenas dois agrupamentos distintos representando fibras musculares esqueléticas lentas e rápidas, independentemente de sua composição precisa de MYH. Isso é consistente com análises que utilizam abordagens transcriptômicas de núcleo único, que tipicamente identificam apenas dois agrupamentos mionucleares distintos. 68, 69, 70 Além disso, embora estudos proteômicos anteriores tenham identificado fibras do tipo 2X, essas fibras não se agrupam separadamente do restante das fibras rápidas e apresentam apenas um pequeno número de proteínas com abundância diferencial em comparação com outros tipos de fibras com base em MYH. 14 Esses resultados sugerem que devemos retornar à visão do início do século XX sobre a classificação das fibras musculares, que dividia as fibras musculares esqueléticas humanas não em três classes distintas com base em MYH, mas em dois grupos com base em suas propriedades metabólicas e contráteis. 63
Mais importante ainda, a heterogeneidade das miofibras deve ser considerada em múltiplas dimensões. Estudos “ômicos” anteriores apontaram nessa direção, sugerindo que as fibras musculares esqueléticas não formam agrupamentos discretos, mas estão dispostas ao longo de um contínuo. 11, 13, 14, 64, 71 Aqui, mostramos que, além das diferenças nas propriedades contráteis e metabólicas do músculo esquelético, as miofibras podem ser diferenciadas por características relacionadas às interações célula-célula e aos mecanismos de tradução. De fato, encontramos heterogeneidade ribossômica em fibras musculares esqueléticas que contribui para a heterogeneidade independente dos tipos de fibras lentas e rápidas. A causa subjacente dessa substancial heterogeneidade das miofibras, independente do tipo de fibra lenta ou rápida, permanece obscura, mas pode indicar uma organização espacial especializada dentro dos fascículos musculares que respondem de forma otimizada a forças e cargas específicas,72 comunicação celular especializada ou específica de órgãos com outros tipos celulares no microambiente muscular73,74,75 ou diferenças na atividade ribossômica dentro de miofibras individuais. De fato, a heteroplasmia ribossômica, seja por meio da substituição paralógica de RPL3 e RPL3L ou no nível da 2′O-metilação do rRNA, demonstrou estar associada à hipertrofia do músculo esquelético76,77. Aplicações multiômicas e espaciais combinadas com a caracterização funcional de miofibras individuais irão aprimorar ainda mais nossa compreensão da biologia muscular em nível multiômico78.
Ao analisar os proteomas de miofibras individuais de pacientes com miopatias nemalínicas, demonstramos a utilidade, a eficácia e a aplicabilidade da proteômica de miofibras individuais para elucidar a fisiopatologia clínica do músculo esquelético. Além disso, ao comparar nosso fluxo de trabalho com a análise proteômica global, demonstramos que a proteômica de miofibras individuais fornece a mesma profundidade de informação que a proteômica global do tecido e amplia essa profundidade ao considerar a heterogeneidade interfibras e o tipo de miofibra. Além das diferenças esperadas (embora variáveis) na proporção de tipos de fibra observadas nas miopatias nemalínicas ACTA1 e TNNT1 em comparação com controles saudáveis,¹⁹ também observamos remodelamento oxidativo e extracelular independente da troca de tipo de fibra mediada por MYH. A fibrose já foi relatada em miopatias nemalínicas TNNT1.19 No entanto, nossa análise amplia essa descoberta ao revelar também níveis aumentados de proteínas extracelulares secretadas relacionadas ao estresse, como as anexinas, envolvidas em mecanismos de reparo do sarcolema, em miofibras de pacientes com miopatias nemalínicas ACTA1 e TNNT1.57,58,59 Em conclusão, o aumento dos níveis de anexina em miofibras de pacientes com miopatia nemalínica pode representar uma resposta celular para reparar miofibras gravemente atróficas.
Embora este estudo represente a maior análise ômica de fibra muscular única em humanos até o momento, ele não está isento de limitações. Isolamos fibras musculares esqueléticas de uma amostra relativamente pequena e homogênea de participantes e de um único músculo (o vasto lateral). Portanto, é impossível excluir a existência de populações específicas de fibras em diferentes tipos de músculos e em extremos da fisiologia muscular. Por exemplo, não podemos descartar a possibilidade de um subconjunto de fibras ultrarrápidas (por exemplo, fibras 2X puras) surgir em velocistas altamente treinados e/ou atletas de força⁷⁹ ou durante períodos de inatividade muscular^66,80. Além disso, o tamanho limitado da amostra de participantes nos impediu de investigar diferenças entre os sexos na heterogeneidade das fibras, visto que se sabe que as proporções dos tipos de fibras diferem entre homens e mulheres. Ademais, não foi possível realizar análises transcriptômicas e proteômicas nas mesmas fibras musculares ou em amostras dos mesmos participantes. À medida que nós e outros continuamos a otimizar análises de células individuais e fibras musculares individuais usando análises ômicas para alcançar uma quantidade ultrabaixa de amostras (como demonstrado aqui na análise de fibras de pacientes com miopatia mitocondrial), a oportunidade de combinar abordagens multiômicas (e funcionais) em fibras musculares individuais torna-se evidente.
Em geral, nossos dados identificam e explicam os fatores transcricionais e pós-transcricionais que impulsionam a heterogeneidade do músculo esquelético. Especificamente, apresentamos dados que desafiam um dogma de longa data na fisiologia do músculo esquelético associado à definição clássica de tipos de fibras baseada em MYH. Esperamos renovar o debate e, em última análise, repensar nossa compreensão da classificação e heterogeneidade das fibras musculares esqueléticas.
Quatorze participantes caucasianos (12 homens e 2 mulheres) concordaram voluntariamente em participar deste estudo. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Universitário de Ghent (BC-10237), cumpriu a Declaração de Helsinque de 2013 e foi registrado no ClinicalTrials.gov (NCT05131555). As características gerais dos participantes são apresentadas na Tabela Suplementar 1. Após a obtenção do consentimento livre e esclarecido, verbal e por escrito, os participantes foram submetidos a um exame médico antes da inclusão final no estudo. Os participantes eram jovens (22–42 anos), saudáveis ​​(sem doenças pré-existentes, sem histórico de tabagismo) e moderadamente ativos fisicamente. O consumo máximo de oxigênio foi determinado utilizando um cicloergômetro para avaliação da aptidão física, conforme descrito anteriormente.⁸¹
Amostras de biópsia muscular foram coletadas em repouso e em jejum três vezes, com intervalo de 14 dias. Como essas amostras foram coletadas como parte de um estudo maior, os participantes consumiram placebo (lactose), um antagonista do receptor H1 (540 mg de fexofenadina) ou um antagonista do receptor H2 (40 mg de famotidina) 40 minutos antes da biópsia. Demonstramos anteriormente que esses antagonistas dos receptores de histamina não afetam a aptidão muscular esquelética em repouso⁸¹, e nenhum agrupamento relacionado ao estado foi observado em nossos gráficos de controle de qualidade (Figuras Suplementares 3 e 6). Uma dieta padronizada (41,4 kcal/kg de peso corporal, 5,1 g/kg de peso corporal de carboidratos, 1,4 g/kg de peso corporal de proteínas e 1,6 g/kg de peso corporal de gorduras) foi mantida por 48 horas antes de cada dia experimental, e um café da manhã padronizado (1,5 g/kg de peso corporal de carboidratos) foi consumido na manhã do dia experimental. Sob anestesia local (0,5 ml de lidocaína a 1% sem epinefrina), foram obtidas biópsias musculares do músculo vasto lateral por meio de aspiração percutânea de Bergström.82 As amostras musculares foram imediatamente incluídas em RNAlater e armazenadas a 4°C até a dissecção manual das fibras (até 3 dias).
Feixes de miofibras recém-isolados foram transferidos para meio RNAlater fresco em uma placa de cultura. As miofibras individuais foram então dissecadas manualmente utilizando um estereomicroscópio e pinças finas. Vinte e cinco fibras foram dissecadas de cada biópsia, com especial atenção à seleção de fibras de diferentes áreas da biópsia. Após a dissecção, cada fibra foi delicadamente imersa em 3 μl de tampão de lise (Kit de Lise Celular SingleShot, Bio-Rad) contendo as enzimas proteinase K e DNase para remover proteínas e DNA indesejados. A lise celular e a remoção de proteínas/DNA foram iniciadas por breve agitação em vórtex, centrifugação do líquido em uma microcentrífuga e incubação à temperatura ambiente (10 min). O lisado foi então incubado em um termociclador (T100, Bio-Rad) a 37 °C por 5 min, 75 °C por 5 min e, em seguida, imediatamente armazenado a -80 °C até o processamento posterior.
Bibliotecas de RNA poliadenilado compatíveis com Illumina foram preparadas a partir de 2 µl de lisado de miofibras utilizando o kit QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq Library Prep (Lexogen). Os métodos detalhados podem ser encontrados no manual do fabricante. O processo inicia-se com a síntese da primeira fita de cDNA por transcrição reversa, durante a qual identificadores moleculares únicos (UMIs) e códigos de barras i1 específicos da amostra são introduzidos para garantir o agrupamento das amostras e reduzir a variabilidade técnica durante o processamento subsequente. O cDNA de 96 miofibras é então agrupado e purificado com esferas magnéticas, após o que o RNA é removido e a síntese da segunda fita é realizada utilizando primers aleatórios. A biblioteca é purificada com esferas magnéticas, marcadores i5/i7 específicos do pool são adicionados e amplificada por PCR. Uma etapa final de purificação produz bibliotecas compatíveis com Illumina. A qualidade de cada pool de biblioteca foi avaliada utilizando o kit High Sensitivity Small Fragment DNA Analysis (Agilent Technologies, DNF-477-0500).
Com base na quantificação por Qubit, as amostras foram agrupadas em concentrações equimolares (2 nM). O pool resultante foi então sequenciado em um instrumento NovaSeq 6000 no modo padrão, utilizando o kit de reagentes NovaSeq S2 (1 × 100 nucleotídeos) com uma concentração de 2 nM (4% PhiX).
Nosso pipeline é baseado no pipeline de análise de dados QuantSeq Pool da Lexogen (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). Os dados foram inicialmente desmultiplexados com o bcl2fastq2 (v2.20.0) com base no índice i7/i5. A segunda leitura foi então desmultiplexada com o idemux (v0.1.6) com base no código de barras da amostra i1, e as sequências UMI foram extraídas com o umi_tools (v1.0.1). As leituras foram então aparadas com o cutadapt (v3.4) em múltiplas rodadas para remover leituras curtas (<20 pares de bases) ou leituras compostas exclusivamente por sequências adaptadoras. As leituras foram então alinhadas ao genoma humano usando o STAR (v2.6.0c), e os arquivos BAM foram indexados com o SAMtools (v1.11). Leituras duplicadas foram removidas usando o umi_tools (v1.0.1). Por fim, a contagem de alinhamentos foi realizada usando o featureCounts no Subread (v2.0.3). O controle de qualidade foi realizado usando o FastQC (v0.11.9) em vários estágios intermediários do pipeline.
Todo o processamento bioinformático e a visualização subsequentes foram realizados em R (v4.2.3), principalmente utilizando o fluxo de trabalho Seurat (v4.4.0).⁸³ Portanto, os valores UMI individuais e as matrizes de metadados foram transformados em objetos Seurat. Genes expressos em menos de 30% de todas as fibras foram removidos. Amostras de baixa qualidade foram removidas com base em um limite mínimo de 1000 valores UMI e 1000 genes detectados. Finalmente, 925 fibras passaram por todas as etapas de filtragem de controle de qualidade. Os valores UMI foram normalizados utilizando o método Seurat SCTransform v2,⁸⁴ incluindo todas as 7418 características detectadas, e as diferenças entre os participantes foram regredidas. Todos os metadados relevantes podem ser encontrados no Conjunto de Dados Suplementares 28.