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O crescimento microbiano de feridas geralmente se manifesta como biofilmes, que interferem na cura e são difíceis de erradicar. Novos curativos de prata afirmam combater infecções de feridas, mas sua eficácia de antibiofilme e efeitos de cura independentes da infecção são geralmente desconhecidos. Utilizando modelos de biofilme in vitro e in vivo de Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa, relatamos a eficácia dos curativos geradores de íons Ag1+; AG1+ curativos contendo ácido etilenodiaminetetraacético e cloreto de benzetônio (Ag1+/EDTA/BC) e curativos contendo nitrato de prata (AG oxysalts). , que produzem íons Ag1+, Ag2+ e Ag3+ para combater o biofilme da ferida e seu efeito na cicatrização. Os curativos AG1+ tiveram efeitos mínimos no biofilme de ferida in vitro e em camundongos (C57BL/6J). Em contraste, os sais de Ag 1+/EDTA/BC oxigenados reduziram significativamente o número de bactérias viáveis em biofilmes in vitro e demonstraram uma redução significativa nos componentes bacterianos e de EPS nas biofilmes de feridas de camundongos. Esses curativos tiveram efeitos diferentes na cicatrização de feridas infectadas com biofilme e não infectadas por biofilme, com curativos de sal oxigenados tendo efeitos mais benéficos na reepitelização, tamanho da ferida e inflamação em comparação com tratamentos de controle e outros curativos de prata. As diferentes propriedades físico-químicas dos curativos de prata podem ter efeitos diferentes no biofilme e na cura da ferida, e isso deve ser considerado ao selecionar um curativo para o tratamento de feridas infectadas com biofilme.
As feridas crônicas são definidas como "feridas que não conseguem progredir nos estágios normais da cura de maneira ordenada e oportuna" 1. As feridas crônicas criam uma carga psicológica, social e econômica para os pacientes e o sistema de saúde. Os gastos anuais do NHS no tratamento de feridas e comorbidades associadas são estimados em £ 8,3 bilhões em 2017-182. Atualmente, as feridas crônicas também são um problema premente nos Estados Unidos, com o Medicare estimando o custo anual do tratamento de pacientes com feridas de US $ 28,1 a US $ 96,8 bilhões3.
A infecção é um fator importante que impede a cicatrização de feridas. As infecções geralmente se manifestam como biofilmes, que estão presentes em 78% das feridas crônicas não de cura. Os biofilmes se formam quando os microorganismos se tornam irreversivelmente ligados às superfícies, como superfícies de feridas, e podem se agregar para formar comunidades produtoras de polímero extracelular (EPS). O biofilme da ferida está associado a uma resposta inflamatória aumentada, levando a danos nos tecidos, que podem atrasar ou impedir a cura4. O aumento dos danos nos tecidos pode ser devido em parte ao aumento da atividade das metaloproteinases da matriz, colagenase, elastase e espécies reativas de oxigênio5. Além disso, células inflamatórias e biofilmes são altos consumidores de oxigênio e, portanto, podem causar hipóxia local, esgotando células do oxigênio vital necessário para o reparo eficaz do tecido6.
Os biofilmes maduros são altamente resistentes a agentes antimicrobianos, exigindo estratégias agressivas para controlar infecções por biofilme, como tratamento mecânico seguido de tratamento antimicrobiano eficaz. Como os biofilmes podem se regenerar rapidamente, os antimicrobianos eficazes podem reduzir o risco de re-formação após o desbridamento cirúrgico7.
A prata é cada vez mais usada em curativos antimicrobianos e é frequentemente usada como tratamento de primeira linha para feridas infectadas crônicas. Existem muitos curativos de prata disponíveis no mercado, cada um contendo uma composição, concentração e matriz de base diferentes. Os avanços nas braçadeiras prateadas levaram ao desenvolvimento de novas braçadeiras prateadas. A forma metálica de prata (Ag0) é inerte; Para alcançar a eficácia antimicrobiana, deve perder um elétron para formar prata iônica (Ag1+). Os curativos de prata tradicionais contêm compostos de prata ou prata metálica que, quando expostos ao líquido, decompõem -se para formar íons Ag1+. Esses íons Ag1+ reagem com a célula bacteriana, removendo elétrons de componentes estruturais ou processos críticos necessários para a sobrevivência. A tecnologia patenteada levou ao desenvolvimento de um novo composto de prata, AG Oxysalts (nitrato de prata, AG7NO11), que está incluído em curativos. Ao contrário da prata tradicional, a decomposição de sais contendo oxigênio produz estados de prata com maior valência (Ag1+, Ag2+e Ag3+). Estudos in vitro mostraram que baixas concentrações de sais de prata oxigenadas são mais eficazes que a prata de íons únicos (Ag1+) contra bactérias patogênicas como Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus e Escherichia coli8,9. Outro novo tipo de curativo de prata inclui ingredientes adicionais, como o ácido etilenodiaminetetraacético (EDTA) e cloreto de benzetônio (BC), que são relatados como alvo de biofilme EPS e, assim, aumentam a penetração da prata no biofilme. Essas novas tecnologias de prata oferecem novas maneiras de atingir biofilmes de ferida. No entanto, o impacto desses antimicrobianos no ambiente da ferida e na cicatrização independente da infecção é importante para garantir que eles não criem um ambiente desfavorável da ferida ou a cicatrização de atraso. As preocupações com a citotoxicidade de prata in vitro foram relatadas com vários curativos de prata10,11. No entanto, a citotoxicidade in vitro ainda não se traduz em toxicidade in vivo, e vários curativos AG1+ demonstraram um bom perfil de segurança12.
Aqui, investigamos a eficácia dos curativos de carboximetilcelulose contendo novas formulações de prata contra biofilme de ferida in vitro e in vivo. Além disso, foram avaliados os efeitos desses curativos nas respostas imunes e na cura independente da infecção.
Todos os curativos usados estavam disponíveis comercialmente. O molho de fibra de gel Kerracel 3M (3M, Knutsford, Reino Unido) é um molho de fibra de gel de carboximetilcelulose 100% não antimicrobiano (CMC) que foi usado como curativo de controle neste estudo. Foram avaliados três curativos de prata CMC antimicrobianos, a saber, o curativo Kerracel AG (3M, Knutsford, Reino Unido), que contém 1,7%em peso. sal de prata oxigenado (Ag7NO11) em íons de prata de valência mais alta (Ag1+, Ag2+e Ag3+). Durante a decomposição dos íons Ag7NO11, Ag1+, Ag2+ e Ag3+ são formados em uma proporção de 1: 2: 4. O curativo extra de Aquacel AG contendo 1,2% de cloreto de prata (AG1+) (Convatec, Deeside, Reino Unido) 13 e molho AGACEL AG+Extra contendo 1,2% de cloreto de prata (Ag1+), EDTA e cloreto de benzetônio (Convatec, Deeside, Reino Unido) 14.
As cepas utilizadas neste estudo foram Pseudomonas aeruginosa NCTC 10781 (Public Health England, Salisbury) e Staphylococcus aureus NCTC 6571 (Public Health England, Salisbury).
As bactérias foram cultivadas durante a noite em caldo Muller-Hinton (oxóide, Altrincham, Reino Unido). A cultura noturna foi então diluída 1: 100 em caldo de Mueller-Hinton e 200 µl banhado em membranas estéreis de 0,2 µm de Whatman Cyclopore (Whatman Plc, Maidstone, Reino Unido) em placas de ágar Mueller-Hinton (Sigma-Aldrich Company, Kent, Kent, Gledain ). ) Formação colonial de biofilme a 37 ° C por 24 horas. Esses biofilmes coloniais foram testados quanto ao encolhimento logarítmico.
Corte o molho em pedaços quadrados de 3 cm2 e pré-montete com água desionizada estéril. Coloque o curativo sobre o biofilme da colônia na placa de ágar. Cada 24 ha de biofilme foi removido e as bactérias viáveis dentro do biofilme (UFC/ml) foram quantificadas por diluição serial (10-1 a 10 a 7) em caldo de neutralização de ângulo de dia (Merck-miliporo). Após 24 horas de incubação a 37 ° C, foram realizadas contagens de placas padrão em placas de ágar Mueller-Hinton. Cada tratamento e ponto no tempo foram realizados em triplicado e a contagem de placas foi repetida para cada diluição.
A pele da barriga de porco é obtida de grandes porcos brancos femininos dentro de 15 minutos após o abate de acordo com os padrões de exportação da União Europeia. A pele foi raspada e limpa com toalhetes de álcool, depois congelados a -80 ° C por 24 horas para desvitalizar a pele. Após o degelo, 1 cm2 de peças de pele foram lavadas três vezes com PBS, hipoclorito de sódio a 0,6% e etanol a 70% por 20 minutos de cada vez. Antes de remover a epiderme, remova qualquer etanol restante lavando 3 vezes em PBS estéril. A pele foi cultivada em uma placa de 6 poços com uma membrana de nylon de 0,45 μm de espessura (Merck-milipore) na parte superior e 3 almofadas absorventes (Merck-miliporo) contendo 3 ml de soro fetal bovino (sigma) suplementado com 10% de dulbecco modificado Águia. Médio (Medi -Eagle modificado de Dulbecco - Aldrich Ltd.).
Os biofilmes coloniais foram cultivados conforme descrito para estudos de exposição ao biofilme. Depois de cultivar o biofilme na membrana por 72 horas, o biofilme foi aplicado à superfície da pele usando um loop estéril de inoculação e a membrana foi removida. O biofilme foi então incubado na derme do porco por mais 24 horas a 37 ° C para permitir que o biofilme amadurece e siga a pele do porco. Depois que o biofilme amadureceu e preso, um curativo de 1,5 cm2, pré-marcado com água destilada estéril, foi aplicada diretamente à superfície da pele e incubada a 37 ° C por 24 horas. As bactérias viáveis foram visualizadas por manchas aplicando uniformemente o reagente de viabilidade de células pré -mamas (Invitrogen, Life Technologies, Paisley, Reino Unido) à superfície apical de cada explante e incubando -o por 5 minutos. Use a câmera digital Leica DFC425 para capturar instantaneamente imagens no microscópio Leica MZ8. As áreas coloridas rosa foram quantificadas usando o Image Pro Software versão 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD Image-pro (mediacy.com)). A microscopia eletrônica de varredura foi realizada conforme descrito abaixo.
As bactérias cultivadas durante a noite foram diluídas 1: 100 no caldo Mueller-Hinton. 200 μl de cultura foram adicionados à membrana estéril de 0,2 μM de cicloporo Whatman (Whatman, Maidstone, Reino Unido) e banhado no ágar Mueller-Hinton. As placas de biofilme foram incubadas a 37 ° C por 72 horas para permitir a formação madura de biofilme.
Após 3 dias de maturação do biofilme, uma bandagem quadrada de 3 cm2 foi colocada diretamente no biofilme e incubada a 37 ° C por 24 horas. Depois de remover o curativo da superfície do biofilme, 1 ml de reagente de viabilidade de células pré -sublue (Invitrogen, Waltham, MA) foi adicionado à superfície de cada biofilme por 20 segundos. As superfícies foram secas antes que as mudanças de cor fossem gravadas usando uma câmera digital da Nikon D2300 (Nikon UK Ltd., Kingston, Reino Unido).
Prepare culturas noturnas no Agar Mueller-Hinton, transfira colônias individuais para caldo de 10 ml Mueller-Hinton e incubem em um agitador a 37 ° C (100 rpm). Após a incubação durante a noite, a cultura foi diluída 1: 100 no caldo Mueller-Hinton e 300 µl foi visto em membrana circular de Whatman Cyclopore de 0,2 µm (Whatman International, Maidstone, Reino Unido) em Mueller-Hinton Agar e incubada a 37 ° C dentro de 72 horas) . . O biofilme maduro foi aplicado à ferida, conforme descrito abaixo.
Todo o trabalho com animais foi realizado na Universidade de Manchester sob uma licença de projeto aprovada pelo Escritório de Bem -Estar Animal e Revisão Ética (P8721BD27) e de acordo com as diretrizes publicadas pelo Home Office sob a ASPA revisada de 2012. Todos os autores aderiram às diretrizes de chegada. Camundongos C57BL/6J de oito semanas de idade (Envigo, Oxon, Reino Unido) foram utilizados para todos os estudos in vivo. Os ratos foram anestesiados com isoflurano (Piramal Critical Care Ltd, West Drayton, Reino Unido) e suas superfícies dorsais foram raspadas e limpas. Cada mouse recebeu uma ferida excisional de 2 × 6 mm usando um soco de biópsia do Stiefel (Schuco International, Hertfordshire, Reino Unido). Para feridas infectadas por biofilme, aplique biofilme colonial de 72 horas cultivado na membrana, conforme descrito acima, na camada dérmica da ferida usando um loop estéril de inoculação imediatamente após a lesão e descarte a membrana. Um centímetro quadrado de curativo é pré-marcado com água estéril para manter um ambiente úmido da ferida. Os curativos foram aplicados diretamente a cada ferida e cobertos com filme de 3m tegaderm (3M, Bracknell, Reino Unido) e adesivo líquido de mastisol (eloquei Healthcare, Ferndale, MI) aplicado ao redor das bordas para fornecer adesão adicional. A buprenorfina (AnimalCare, York, Reino Unido) foi administrada a uma concentração de 0,1 mg/kg como analgésica. Camundongos abatem -se três dias após a lesão usando o método da programação 1 e remove, reduzem a metade e guarde a área da ferida, conforme necessário.
A coloração de hematoxilina (Thermofisher Scientific) e eosina (Termofisher Scientific) foi realizada de acordo com o protocolo do fabricante. A área de feridas e a reepitelialização foram quantificadas usando o Image Pro Software versão 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD).
As seções de tecido foram deswaxadas em xileno (Thermofisher Scientific, Loughborough, Reino Unido), reidratadas com 100 a 50% de etanol classificada e imersos brevemente em água desionizada (Thermofisher Scientific). A imuno-histoquímica foi realizada usando o kit Vectastain Elite ABC PK-6104 (Vector Laboratories, Burlingame, CA) de acordo com o protocolo do fabricante. Os anticorpos primários para neutrófilos NIMP-R14 (Thermofisher Scientific) e macrófagos MS CD107B Pure M3/84 (BD Biosciences, Wokingham, Reino Unido) foram diluídos 1: 100 em solução de bloqueio e adicionados à superfície cortada, seguidos por 2 anticorpos anticorpos, Vectastain O ABC e o vetor Nova Peroxidase Red Peroxidase (HRP) Kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA) e contrastaram com hematoxilina. As imagens foram adquiridas usando um microscópio Olympus BX43 e uma câmera digital do Olympus DP73 (Olympus, Southend-on-Sea, Reino Unido).
As amostras de pele foram fixadas em glutaraldeído a 2,5% e 4% de formaldeído em HEPES 0,1 M (pH 7,4) por 24 horas a 4 ° C. As amostras foram desidratadas usando etanol graduado e secas em CO2 usando um secador de ponto crítico quorum k850 (Quorum Technologies Ltd, Loughton, Reino Unido) e pulverizada com liga de ouro-calládio usando um sistema de desbravador de mini quorum sc7620. As amostras foram fotografadas usando um microscópio eletrônico de varredura FEI Quanta 250 (Thermofisher Scientific) para visualizar o ponto central da ferida.
O iodeto de Toto-1 (2 μM) foi aplicado à superfície da ferida de camundongo excisado e incubado por 5 min a 37 ° C (Thermofisher Scientific) e tratado com Syto-60 (10 μm) a 37 ° C (Thermofisher Scientific). As imagens da pilha Z de 15 minutos foram criadas usando um Leica TCS SP8.
Os dados de replicação biológica e técnica foram tabulados e analisados usando o software GraphPad Prism V9 (Software GraphPad, La Jolla, CA). A análise de variância unidirecional com múltiplas comparações usando o teste post hoc de Dunnett foi usado para testar as diferenças entre cada tratamento e o curativo de controle não antimicrobiano. Um valor de P <0,05 foi considerado significativo.
A eficácia dos curativos fibrosos em gel de prata foi avaliada pela primeira vez contra colônias de biofilme de Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa in vitro. Os curativos de prata contêm diferentes fórmulas de prata: os curativos de prata tradicionais produzem íons Ag1+; Os curativos de prata, que podem produzir íons Ag1+ após a adição de EDTA/BC, podem destruir a matriz de biofilme e expor as bactérias à prata sob o efeito antibacteriano da prata. íons15 e molhos contendo sais de Ag oxigenados que produzem íons Ag1+, Ag2+ e Ag3+. Sua eficácia foi comparada com um curativo de controle não antimicrobiano feito de fibras geladas. As bactérias viáveis restantes dentro do biofilme foram avaliadas a cada 24 horas por 8 dias (Figura 1). No dia 5, o biofilme foi reinoculado com 3,85 × 105s. Staphylococcus aureus ou 1,22 × 105p. Aeruginosa para avaliar a recuperação de biofilme. Comparados aos curativos de controle não antimicrobiano, os curativos AG1+ tiveram efeito mínimo na viabilidade bacteriana em biofilmes de Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa em 5 dias. Por outro lado, os curativos que contêm sais oxigenados de Ag e Ag1 + + EDTA/BC foram eficazes na morte de bactérias dentro do biofilme dentro de 5 dias. Após inoculação repetida com bactérias planctônicas no dia 5, não foi observada restauração do biofilme (Fig. 1).
Quantificação de bactérias viáveis em biofilmes de Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa após tratamento com curativos de prata. As colônias de biofilme de Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa foram tratadas com curativos de prata ou curativos de controle não antimicrobiano, e o número de bactérias viáveis restantes foi determinado a cada 24 horas. Após 5 dias, o biofilme foi reinoculado com 3,85 × 105s. Staphylococcus aureus ou 1,22 × 105p. As colônias do bacterioplâncton pseudomonas aeruginosa foram formadas individualmente para avaliar a recuperação do biofilme. Os gráficos mostram média +/- erro padrão.
Para visualizar o efeito de curativos de prata na viabilidade do biofilme, os curativos foram aplicados a biofilmes maduros cultivados na pele porcina ex vivo. Após 24 horas, o curativo é removido e o biofilme é corado com um corante reativo azul, que é metabolizado por bactérias vivas em uma cor rosa. Os biofilmes tratados com curativos de controle eram rosa, indicando a presença de bactérias viáveis dentro do biofilme (Figura 2a). Por outro lado, o biofilme tratado com o curativo Ag oxysols era principalmente azul, indicando que as bactérias restantes na superfície da pele do porco eram bactérias não viáveis (Figura 2B). A coloração azul e rosa mista foi observada em biofilmes tratados com molhos contendo ag1+, indicando a presença de bactérias viáveis e não viáveis no biofilme (Figura 2C), enquanto os curativos EDTA/BC contendo Ag1+ eram predominantemente azuis com alguns pontos de rosa. indicando áreas não afetadas pelo curativo de prata (Figura 2D). A quantificação de áreas ativas (rosa) e inativas (azuis) mostrou que o adesivo de controle era 75% ativo (Figura 2e). Os curativos AG1 + + EDTA/BC tiveram um desempenho semelhante aos curativos de sal de AG oxigenados, com taxas de sobrevivência de 13% e 14%, respectivamente. O curativo AG1+ também reduziu a viabilidade bacteriana em 21%. Esses biofilmes foram então observados usando microscopia eletrônica de varredura (MEV). Após o tratamento com o curativo de controle e o curativo AG1+, foi observada uma camada de Pseudomonas aeruginosa cobrindo a pele porcina (Figura 2F, H), enquanto após o tratamento com o curativo Ag1+, foram encontradas poucas células bacterianas e poucas células bacterianas foram encontradas abaixo. As fibras de colágeno podem ser consideradas como a estrutura do tecido da pele porcina (Figura 2G). Após o tratamento com curativo Ag1 + + EDTA/BC, as placas bacterianas e as placas de fibra de colágeno subjacentes eram visíveis (Figura 2I).
Visualização do biofilme de Pseudomonas aeruginosa após tratamento de molho de prata. (A-D) A viabilidade bacteriana em biofilmes de Pseudomonas aeruginosa cultivada na pele porcina foi visualizada usando corante de viabilidade pré-sublue 24 horas após o tratamento com curativos de prata ou curativos de controle não antimicrobiano. As bactérias vivas são rosa, bactérias não viáveis e pele de porco são azuis. (E) Quantificação de biofilmes de pseudomonas aeruginosa cultivados na pele porcina (mancha rosa) usando a microscopia eletrônica de varredura Imagem Pro versão 10 (FI) e tratada com um curativo de prata ou um curativo de controle não antimicrobiano por 24 horas. Barra de escala SEM = 5 µm. (J -M) Os biofilmes coloniais cresceram em filtros e foram corados com corante reativo de pré -mamão após 24 h de incubação com curativos de prata.
Para determinar se o contato próximo entre os curativos e os biofilmes afetou a eficácia dos curativos, os biofilmes coloniais colocados em uma superfície plana foram tratados com os curativos por 24 horas e depois corados com corantes reativos. O biofilme não tratado era de cor rosa escura (Figura 2J). Em contraste com os biofilmes tratados com curativos contendo sais de AG oxigenados (Figura 2K), os biofilmes tratados com curativos contendo Ag1+ ou Ag1+++ EDTA/BC mostraram faixas de coloração rosa (Figura 2L, M). Esta coloração rosa indica a presença de bactérias viáveis e está associada à área da sutura dentro do curativo. Essas áreas costuradas criam espaços mortos que permitem que bactérias dentro do biofilme sobrevivam.
Para avaliar a eficácia dos curativos de prata in vivo, as feridas excisadas de espessura total de camundongos infectadas com biofilmes maduros de S. aureus e P. aeruginosa foram tratados com curativos de controle não antimicrobiano ou curativos de prata. Após 3 dias de tratamento, a análise de imagem macroscópica mostrou tamanhos menores de feridas quando tratados com curativos de sal oxigenados em comparação com os curativos de controle não antimicrobianos e outros curativos de prata (Figura 3A-H). Para confirmar essas observações, as feridas foram colhidas e a área de feridas e a reepitelização foram quantificadas em seções de tecido coradas com hematoxilina e eosina usando o software Image Pro versão 10 (Figura 3i-L).
O efeito de curativos de prata na superfície da ferida e reepitelização de feridas infectadas com biofilmes. (A -H) Células pequenas infectadas com biofilmes de Pseudomonas aeruginosa (A -D) e Staphylococcus aureus (E -H) após três dias de tratamento com um molho de controle não antimicrobiano, um molho de sal Ag1+ não antimicrobiano, um molho de AG1+ oxigenado, e um curativo AG1+ vestir. Imagens macroscópicas representativas. Feridas de camundongos com molho Ag1 + + EDTA/BC. (IL) Infecção representativa de Pseudomonas aeruginosa, seções histológicas coradas com hematoxilina e eosina, usadas para quantificar a área da ferida e a regeneração epitelial. Quantificação da área da ferida (M, O) e porcentagem de reepitelialização (N, P) de feridas infectadas com Pseudomonas aeruginosa (M, N) e Staphylococcus aureus (O, P) Biofilmes (por grupo de tratamento N = 12). Os gráficos mostram média +/- erro padrão. * significa p = <0,05 ** significa p = <0,01; Escala macroscópica = 2,5 mm, escala histológica = 500 µm.
A quantificação da área da ferida em feridas infectadas com o biofilme de Pseudomonas aeruginosa (Figura 3M) mostrou que as feridas tratadas com o oxisseno AG tinham um tamanho médio de 2,5 mm2, enquanto o curativo de controle não antimicrobiano teve um tamanho médio de ferida de 3,1 mm2, o que não é não é verdadeiro. atingiu significância estatística (Figura 3M). p = 0,423). As feridas tratadas com Ag1+ ou Ag1++ EDTA/BC não mostraram redução na área da ferida (3,1 mm2 e 3,6 mm2, respectivamente). O tratamento com curativo de sal ag que oxigenado promoveu a reepitelização em uma extensão maior do que o curativo de controle não antimicrobiano (34% e 15%, respectivamente; p = 0,029) e ag1+ ou ag1++ edta/bc (10% e 11%) ( Figura 3n). . , respectivamente).
Tendências semelhantes na área da ferida e regeneração epitelial foram observadas em feridas infectadas com biofilmes de S. aureus (Figura 3O). Os curativos contendo sais de prata oxigenados reduziram a área da ferida (2,0 mm2) em 23% em comparação com o curativo não antimicrobiano controle (2,6 mm2), embora essa redução não tenha sido significativa (p = 0,304) (Fig. 3O). Além disso, a área da ferida no grupo de tratamento AG1+ foi ligeiramente reduzida (2,4 mm2), enquanto a ferida tratada com o curativo Ag1++ EDTA/BC não reduziu a área da ferida (2,9 mm2). Os sais de oxigênio de Ag também promoveram a reepitelização de feridas infectadas com o biofilme de S. aureus (31%) em uma extensão maior do que aquelas tratadas com curativos de controle não antimicrobiano (12%, p = 0,003) (Figura 3p). O curativo Ag1+ (16%, P = 0,903) e o curativo AG+ 1+ EDTA/BC (14%, P = 0,965) mostraram níveis de regeneração epitelial semelhante ao controle.
Para visualizar o efeito dos curativos de prata na matriz de biofilme, foi realizada a coloração com toto 1 e syto 60 iodeto (Fig. 4). O iodeto de Toto 1 é um corante impermeável à célula que pode ser usado para visualizar com precisão os ácidos nucleicos extracelulares, que são abundantes nos EPs dos biofilmes. SYTO 60 é um corante permeável à célula usado como contra -alfinete16. As observações de Toto 1 e Syto 60 iodeto em feridas inoculadas com biofilmes de Pseudomonas aeruginosa (Figura 4A-D) e Staphylococcus aureus (Figura 4i-L) mostraram que, após 3 dias de tratamento, o EPS no biofilme foi significativamente reduzido. contendo sais oxigenados AG e AG1 + + EDTA/BC. Os curativos AG1+ sem componentes de antibiofilme adicionais reduziram significativamente o DNA livre de células em feridas inoculadas com Pseudomonas aeruginosa, mas foram menos eficazes em feridas inoculadas com Staphylococcus aureus.
Imagem in vivo do biofilme de feridas após 3 dias de tratamento com curativos de controle ou prateados. Imagens confocais de Pseudomonas aeruginosa (A -D) e Staphylococcus aureus (I -L) coradas com Toto 1 (verde) para visualizar ácidos nucleicos extracelulares, um componente dos polímeros de biofilme extracelulares. Para manchar os ácidos nucleicos intracelulares, use syto 60 (vermelho). ácidos. P. Microscopia eletrônica de varredura de feridas infectadas com biofilmes de Pseudomonas aeruginosa (E -H) e Staphylococcus aureus (M - P) após 3 dias de tratamento com curativos de controle e prata. Barra de escala SEM = 5 µm. Barra de escala de imagem confocal = 50 µm.
A microscopia eletrônica de varredura mostrou que camundongos inoculados com colônias de biofilme de Pseudomonas aeruginosa (Figura 4E-H) e Staphylococcus aureus (Figura 4M-P) apresentaram significativamente menos bactérias em suas feridas após 3 dias de tratamento com todos os vestidos de prata.
Para avaliar o efeito de curativos de prata na inflamação da ferida em camundongos infectados por biofilme, seções de feridas infectadas com biofilme tratadas com curativos de controle ou prateado por 3 dias foram imuno-histoquimicamente coradas usando anticorpos específicos para neutrófilos e macrófagos. Determinação quantitativa de neutrófilos e macrófagos internamente. tecido de granulação. Figura 5). Todos os curativos de prata reduziram o número de neutrófilos e macrófagos em feridas infectadas com Pseudomonas aeruginosa em comparação com os curativos de controle não antimicrobiano após três dias de tratamento. No entanto, o tratamento com o curativo de sal de prata oxigenado resultou em uma maior redução de neutrófilos (p = <0,0001) e macrófagos (p = <0,0001) em comparação com outros curativos de prata testados (Figura 5i, J). Embora AG1++ EDTA/BC tenha um efeito maior no biofilme da ferida, reduziu os níveis de neutrófilos e macrófagos em menor grau que o curativo Ag1+. Feridas moderadas infectadas com biofilme de S. aureus também foram observadas após o curativo com Ag (P = <0,0001), Ag1+ (P = 0,0008) e AG1 ++ EDTA/BC (p = 0,0043) oxisóis em comparação com o controle. Tendências semelhantes são observadas para neutropenia. Bandagem (Fig. 5K). No entanto, apenas o curativo de sal Ag oxigenado mostrou uma redução significativa no número de macrófagos no tecido de granulação em comparação com o controle em feridas infectadas com biofilmes de S. aureus (p = 0,0339) (Figura 5L).
Neutrófilos e macrófagos foram quantificados em feridas infectadas com Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus biofilmes após 3 dias de tratamento com controle não antimicrobiano ou molhos de prata. Os neutrófilos (AD) e macrófagos (EH) foram quantificados em seções de tecido coradas com anticorpos específicos para neutrófilos ou macrófagos. Quantificação de neutrófilos (I e K) e macrófagos (J e L) em feridas infectadas com Pseudomonas aeruginosa (I e J) e Biofilmes de Staphylococcus aureus (K&L). N = 12 por grupo. Os gráficos mostram média +/- erro padrão, valores de significância em comparação com o curativo de controle não antibacteriano, * significa p = <0,05, ** significa p = <0,01; *** significa p = <0,001; indica p = <0,0001).
Em seguida, avaliamos o efeito de curativos de prata na cura independente da infecção. Feridas excisionais não infectadas foram tratadas com um curativo de controle não antimicrobiano ou um curativo de prata por 3 dias (Figura 6). Entre os curativos de prata testados, apenas feridas tratadas com o molho de sal oxigenado pareciam menores em imagens macroscópicas do que as feridas tratadas com o controle (Figura 6a-D). A quantificação da área da ferida usando análise histológica mostrou que a área média da ferida após o tratamento com o curativo AG oxysols foi de 2,35 mm2 em comparação com 2,96 mm2 para feridas tratadas com o grupo controle, mas essa diferença não atingiu significância estatística (p = 0,488) (Fig (Fig. 6i). Por outro lado, nenhuma redução na área da ferida foi observada após o tratamento com AG1+ (3,38 mm2, p = 0,757) ou ag1++ EDTA/BC (4,18 mm2, p = 0,054) molhos em comparação com o grupo controle. A regeneração epitelial aumentada foi observada com o curativo AG oxysol em comparação com o grupo controle (30% vs. 22%, respectivamente), embora isso não tenha atingido significância (p = 0,067), isso é bastante significativo e confirma resultados anteriores. Um curativo com oxysols promove a reepitelização. -Epitelização de feridas não infectadas17. Por outro lado, o tratamento com os curativos AG1+ ou AG1++ EDTA/BC não teve efeito ou mostrou diminuição da reepitelização em comparação com o controle.
Efeito do molho de ferida de prata na cicatrização de feridas em camundongos não infectados com ressecção completa. (AD) Imagens macroscópicas representativas de feridas após três dias de tratamento com um curativo de controle não antimicrobiano e um curativo de prata. (EH) Seções representativas da ferida coradas com hematoxilina e eosina. A quantificação da área da ferida (i) e a porcentagem de reepitelização (J) foram calculadas a partir de seções histológicas no ponto médio da ferida usando o software de análise de imagem (n = 11–12 por grupo de tratamento). Os gráficos mostram média +/- erro padrão. * significa p = <0,05.
A prata tem uma longa história de uso como terapia antimicrobiana na cicatrização de feridas, mas as muitas formulações e métodos de entrega diferentes podem resultar em diferenças na eficácia antimicrobiana 18. Além disso, as propriedades de antibiofilme de sistemas específicos de entrega de prata não são totalmente compreendidos. Embora a resposta imune do hospedeiro seja relativamente eficaz contra as bactérias planctônicas, geralmente é menos eficaz contra o Biofilms19. As bactérias planctônicas são prontamente fagocitadas por macrófagos, mas dentro de biofilmes, as células agregadas apresentam problemas adicionais, limitando a resposta do hospedeiro na medida em que as células imunes podem sofrer apoptose e liberar fatores pró -inflamatórios para melhorar a resposta imune20. Observou -se que alguns leucócitos podem penetrar no Biofilms21, mas não conseguem bactérias fagocitose quando essa defesa estiver comprometida22. Uma abordagem holística deve ser usada para apoiar a resposta imune do hospedeiro contra a infecção por biofilme da ferida. O desbridamento da ferida pode interromper fisicamente o biofilme e remover a maior parte do bioburden, mas a resposta imune do hospedeiro pode ser ineficaz contra o biofilme restante, especialmente se a resposta imune do hospedeiro estiver comprometida. Assim, terapias antimicrobianas, como curativos de prata, podem apoiar a resposta imune do hospedeiro e eliminar infecções por biofilme. Composição, concentração, solubilidade e substrato de entrega podem influenciar a eficácia antimicrobiana da prata. Nos últimos anos, os avanços na tecnologia de processamento de prata tornaram esses curativos mais eficazes9,23. À medida que a tecnologia de molho de prata avança, é importante entender a eficácia desses curativos no controle da infecção da ferida e, mais importante, o impacto dessas formas potentes de prata no ambiente e na cura da ferida.
Neste estudo, comparamos a eficácia de dois curativos prateados avançados com curativos de prata convencionais que produzem íons Ag1+ contra biofilmes usando diferentes modelos in vitro e in vivo. Também avaliamos o efeito desses curativos no ambiente da ferida e na cura independente da infecção. Para minimizar a influência da matriz de entrega, todos os curativos de prata testados foram compostos de carboximetilcelulose.
Nossa avaliação preliminar desses curativos de prata contra biofilmes coloniais de Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus mostra que, diferentemente dos curativos AG1+ tradicionais, dois curativos prateados avançados, Ag1++ EDTA/BC e Saltos AG oxigenados, são efetivos em 5 anos. alguns dias. Além disso, esses curativos impedem a reforma do biofilme após a exposição repetida a bactérias planctônicas. O curativo AG1+ continha cloreto de prata, o mesmo composto de prata e matriz base que AG1++ EDTA/BC, e teve um efeito limitado na viabilidade bacteriana dentro do biofilme no mesmo período. A observação de que um curativo AG1++ EDTA/BC foi mais eficaz contra o biofilme do que um curativo AG1+ que consiste na mesma matriz e um composto de prata suporta a noção de que os ingredientes adicionais são necessários para aumentar a eficácia do cloreto de prata contra o biofilme, como foi relatado em outros lugares15. Esses resultados apóiam a idéia de que o BC e o EDTA desempenham um papel adicional, contribuindo para a eficácia geral do curativo e que a ausência desse componente nos curativos AG1+ pode ter contribuído para o fracasso em demonstrar eficácia in vitro. Descobrimos que os curativos de sal de AG oxigenados que produzem íons Ag2+ e AG3+ exibiam eficácia antibacteriana mais forte do que AG1+ e em níveis semelhantes a Ag1++ EDTA/BC. No entanto, devido ao alto potencial redox, não está claro quanto tempo os íons Ag3+ permanecem ativos e eficazes contra os biofilmes da ferida e, portanto, merecem estudos adicionais. Além disso, existem muitos curativos diferentes que geram íons Ag1+ que não foram testados neste estudo. Esses curativos são compostos de diferentes compostos de prata, concentrações e matrizes básicas, o que pode influenciar a entrega de íons Ag1+ e sua eficácia contra biofilmes. Também vale a pena notar que existem muitos modelos diferentes in vitro e in vivo usados para avaliar a eficácia dos curativos de feridas contra biofilmes. O tipo de modelo usado, bem como o teor de sal e proteína do meio usado nesses modelos, influenciará a eficácia do curativo. Em nosso modelo in vivo, permitimos que o biofilme amadureça in vitro e depois o transferimos para a superfície dérmica da ferida. A resposta imune do rato hospedeiro é relativamente eficaz contra bactérias planctônicas aplicadas à ferida, formando assim um biofilme como a ferida cura. A adição de biofilme maduro a uma ferida limita a eficácia da resposta imune do hospedeiro à formação de biofilme, permitindo que o biofilme maduro se estabeleça dentro da ferida antes que a cura possa começar. Assim, nosso modelo nos permite avaliar a eficácia dos curativos antimicrobianos em biofilmes maduros antes que as feridas comecem a curar.
Também descobrimos que o ajuste do vestuário influenciou a eficácia dos curativos de prata em biofilmes in vitro e pele porcina. O contato próximo com a ferida é considerado crítico para a eficácia antimicrobiana do curativo24,25. Os curativos que contêm sais de AG oxigenados estavam em contato próximo com biofilmes maduros, resultando em uma redução significativa no número de bactérias viáveis dentro do biofilme após 24 horas. Por outro lado, quando tratados com os curativos AG1+ e AG1++ EDTA/BC, um número significativo de bactérias viáveis permaneceu. Esses curativos contêm suturas ao longo de todo o comprimento do curativo, que cria espaços mortos que evitam contato próximo com o biofilme. Em nossos estudos in vitro, essas áreas sem contato impediram a morte de bactérias viáveis dentro do biofilme. Avaliamos a viabilidade bacteriana somente após 24 horas de tratamento; Com o tempo, à medida que o curativo se torna mais saturado, pode haver menos espaço morto, reduzindo a área para essas bactérias viáveis. No entanto, isso destaca a importância da composição do curativo, não apenas o tipo de prata no curativo.
Embora os estudos in vitro sejam úteis para comparar a eficácia de diferentes tecnologias de prata, também é importante entender os efeitos desses curativos nos biofilmes in vivo, onde respostas de tecido hospedeiro e imunes contribuem para a eficácia dos curativos contra biofilmes. O efeito desses curativos nos biofilmes da ferida foi observado usando microscopia eletrônica de varredura e coloração de EPS do biofilme usando corantes de DNA intracelular e extracelular. Descobrimos que, após 3 dias de tratamento, todos os curativos eram eficazes na redução do DNA sem células em feridas infectadas pelo biofilme, mas o curativo AG1+ foi menos eficaz em feridas infectadas com Staphylococcus aureus. A microscopia eletrônica de varredura também mostrou que significativamente menos bactérias estavam presentes em feridas tratadas com os molhos de prata, embora isso tenha sido mais pronunciado com o molho de sal ag e o oxigenado e o curativo Ag1++ EDTA/BC em comparação com o curativo Ag1+. Esses dados mostram que os curativos de prata testados tiveram graus variados de impacto na estrutura do biofilme, mas nenhum dos curativos de prata foi capaz de erradicar o biofilme, apoiando a necessidade de uma abordagem holística do tratamento de infecções por biofilme de feridas; Uso de braçadeiras prateadas. O tratamento é precedido por desbridamento físico para remover a maior parte do biofilme.
As feridas crônicas geralmente estão em um estado de inflamação grave, com células inflamatórias excedentes permanecendo no tecido da ferida por um longo período de tempo, causando danos nos tecidos e esgotando o oxigênio necessário para o metabolismo celular eficiente e a função da ferida26. Os biofilmes exacerbam esse ambiente de ferida hostil, afetando negativamente a cura de várias maneiras, incluindo a inibição da proliferação celular e a migração e a ativação de citocinas pró -inflamatórias27. À medida que os curativos de prata se tornam mais eficazes, é importante entender o impacto que eles têm no ambiente da ferida e na cura.
Curiosamente, embora todos os curativos de prata tenham afetado a composição do biofilme, apenas os curativos de sal de prata oxigenados aumentaram a reepitelização dessas feridas infectadas. Esses dados suportam nossas descobertas anteriores17 e as de Kalan et al. (2017) 28, que demonstraram boa segurança e perfis de toxicidade de sais de prata oxigenados, pois concentrações mais baixas de prata foram eficazes contra biofilmes.
Nosso estudo atual destaca as diferenças na tecnologia de prata entre os curativos de prata antimicrobianos e o impacto dessa tecnologia no ambiente da ferida e na cura independente da infecção. No entanto, esses resultados diferem dos estudos anteriores que mostram que o curativo AG1 + + EDTA/BC melhorou os parâmetros de cicatrização de orelhas de coelho lesionado in vivo. No entanto, isso pode ser devido a diferenças nos modelos animais, tempos de medição e métodos de aplicação bacterianos29. Nesse caso, as medidas de ferida foram realizadas 12 dias após a lesão para permitir que os ingredientes ativos do curativo atuassem no biofilme por um longo período de tempo. Isso é apoiado por um estudo que mostrou que as úlceras das pernas clinicamente infectadas tratadas com Ag1 + + + EDTA/BC aumentaram inicialmente em tamanho após uma semana de tratamento e depois nas próximas 3 semanas após o tratamento com Ag1 + + EDTA/BC e dentro de 4 semanas após Uso de não-antimicrobianos. drogas. CRANDOS CMC para reduzir o tamanho das úlceras30.
Certas formas e concentrações de prata já demonstraram ser citotóxicas in vitro 11, mas esses resultados in vitro nem sempre se traduzem em efeitos adversos in vivo. Além disso, os avanços na tecnologia de prata e uma melhor compreensão dos compostos e concentrações de prata nos curativos levaram ao desenvolvimento de muitos curativos de prata seguros e eficazes. No entanto, à medida que a tecnologia de molho de prata avança, é importante entender o impacto desses curativos no ambiente da ferida31,32,33. Foi relatado anteriormente que o aumento da taxa de reepitelização corresponde a uma proporção aumentada de macrófagos M2 anti-inflamatórios em comparação com o fenótipo M1 pró-inflamatório. Isso foi observado em um modelo anterior de camundongos, onde os curativos de feridas de hidrogel de prata foram comparados com a sulfadiazina prateada e hidrogéis não antimicrobianos34.
As feridas crônicas podem exibir inflamação excessiva e foi observado que a presença de neutrófilos em excesso pode ser prejudicial à cura de feridas35. Em um estudo em camundongos com depleção de neutrófilos, a presença de neutrófilos atrasou a reepitelialização. A presença de neutrófilos em excesso leva a altos níveis de proteases e espécies reativas de oxigênio, como superóxido e peróxido de hidrogênio, que estão associados a feridas crônicas e lentas de cura 37,38. Da mesma forma, um aumento nos números de macrófagos, se não controlado, pode levar ao atraso na cura da ferida39. Esse aumento é particularmente importante se os macrófagos não conseguirem fazer a transição de um fenótipo pró-inflamatório para um fenótipo pró-cicatrização, resultando em feridas falhando em sair da fase inflamatória da cura40. Observamos uma diminuição nos neutrófilos e macrófagos em feridas infectadas por biofilme após 3 dias de tratamento com todos os curativos de prata, mas a diminuição foi mais pronunciada com os curativos de sal oxigenados. Essa diminuição pode ser um resultado direto da resposta imune à prata, uma resposta à diminuição da bioburden ou a ferida em um estágio posterior da cura e, portanto, células imunes na ferida que está sendo reduzida. Reduzir o número de células inflamatórias na ferida pode manter um ambiente propício à cicatrização de feridas. O mecanismo de ação de como a AG oxysalts promove a cicatrização independente da infecção não é clara, mas a capacidade dos oxisalos ag de produzir oxigênio e destruir níveis prejudiciais de peróxido de hidrogênio, um mediador da inflamação, pode explicar isso e requer mais estudos17.
As feridas infectadas por não cicatrização crônicas representam um problema para médicos e pacientes. Embora muitos curativos reivindiquem eficácia antimicrobiana, a pesquisa raramente se concentra em outros fatores -chave que influenciam o microambiente da ferida. Este estudo mostra que diferentes tecnologias de prata têm diferentes efeitos antimicrobianos e, principalmente, diferentes efeitos no ambiente da ferida e na cura, independentemente da infecção. Embora esses estudos in vitro e in vivo mostrem a eficácia desses curativos no tratamento de infecções de feridas e na promoção da cura, são necessários ensaios clínicos randomizados para avaliar a eficácia desses curativos na clínica.
Os conjuntos de dados utilizados e/ou analisados durante o presente estudo estão disponíveis no autor correspondente mediante solicitação razoável.
Hora de postagem: Jul-15-2024