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O crescimento microbiano em feridas frequentemente se manifesta na forma de biofilmes, que interferem na cicatrização e são difíceis de erradicar. Novos curativos à base de prata afirmam combater infecções em feridas, mas sua eficácia antibiofilme e seus efeitos cicatrizantes independentes de infecção são geralmente desconhecidos. Utilizando modelos de biofilme in vitro e in vivo de Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa, relatamos a eficácia de curativos geradores de íons Ag1+; curativos de Ag1+ contendo ácido etilenodiaminotetracético e cloreto de benzethônio (Ag1+/EDTA/BC) e curativos contendo nitrato de prata (oxissais de Ag), que produzem íons Ag1+, Ag2+ e Ag3+ para combater o biofilme da ferida e seu efeito na cicatrização. Os curativos de Ag1+ apresentaram efeitos mínimos sobre o biofilme da ferida in vitro e em camundongos (C57BL/6j). Em contraste, os curativos com sais de prata oxigenados e Ag1+/EDTA/BC reduziram significativamente o número de bactérias viáveis em biofilmes in vitro e demonstraram uma redução significativa nos componentes bacterianos e da matriz extracelular polimérica (EPS) em biofilmes de feridas de camundongos. Esses curativos apresentaram efeitos diferentes na cicatrização de feridas infectadas e não infectadas por biofilme, sendo que os curativos com sais oxigenados demonstraram efeitos mais benéficos na reepitelização, no tamanho da ferida e na inflamação, em comparação com os tratamentos controle e outros curativos de prata. As diferentes propriedades físico-químicas dos curativos de prata podem ter efeitos distintos sobre o biofilme e a cicatrização de feridas, e isso deve ser considerado na seleção de um curativo para o tratamento de feridas infectadas por biofilme.
Feridas crônicas são definidas como “feridas que não progridem pelas fases normais de cicatrização de maneira ordenada e oportuna”¹. As feridas crônicas criam um fardo psicológico, social e econômico para os pacientes e para o sistema de saúde. Estima-se que o gasto anual do NHS (Serviço Nacional de Saúde do Reino Unido) com o tratamento de feridas e comorbidades associadas tenha sido de £ 8,3 bilhões em 2017–2018². As feridas crônicas também representam um problema urgente nos Estados Unidos, onde o Medicare estima o custo anual do tratamento de pacientes com feridas entre US$ 28,1 bilhões e US$ 96,8 bilhões³.
A infecção é um fator importante que impede a cicatrização de feridas. As infecções frequentemente se manifestam como biofilmes, presentes em 78% das feridas crônicas que não cicatrizam. Os biofilmes se formam quando os microrganismos se aderem irreversivelmente a superfícies, como a superfície da ferida, e podem se agregar para formar comunidades produtoras de polímeros extracelulares (EPS). O biofilme da ferida está associado a uma resposta inflamatória aumentada, levando a danos teciduais que podem atrasar ou impedir a cicatrização. O aumento dos danos teciduais pode ser devido, em parte, ao aumento da atividade de metaloproteinases da matriz, colagenase, elastase e espécies reativas de oxigênio. Além disso, as células inflamatórias e os biofilmes são grandes consumidores de oxigênio e, portanto, podem causar hipóxia tecidual local, privando as células do oxigênio vital necessário para o reparo tecidual eficaz.
Biofilmes maduros são altamente resistentes a agentes antimicrobianos, exigindo estratégias agressivas para o controle de infecções por biofilme, como tratamento mecânico seguido de tratamento antimicrobiano eficaz. Como os biofilmes podem se regenerar rapidamente, antimicrobianos eficazes podem reduzir o risco de recorrência após desbridamento cirúrgico.
A prata é cada vez mais utilizada em curativos antimicrobianos e frequentemente empregada como tratamento de primeira linha para feridas crônicas infectadas. Existem muitos curativos de prata disponíveis comercialmente, cada um contendo uma composição, concentração e matriz base de prata diferentes. Os avanços em pulseiras de prata levaram ao desenvolvimento de novas pulseiras de prata. A forma metálica da prata (Ag0) é inerte; para alcançar eficácia antimicrobiana, ela precisa perder um elétron para formar prata iônica (Ag1+). Os curativos de prata tradicionais contêm compostos de prata ou prata metálica que, quando expostos a líquidos, se decompõem para formar íons Ag1+. Esses íons Ag1+ reagem com a célula bacteriana, removendo elétrons de componentes estruturais ou processos críticos necessários para a sobrevivência. A tecnologia patenteada levou ao desenvolvimento de um novo composto de prata, os oxissais de prata (nitrato de prata, Ag7NO11), que é incorporado em curativos. Diferentemente da prata tradicional, a decomposição de sais contendo oxigênio produz estados de prata com valência mais alta (Ag1+, Ag2+ e Ag3+). Estudos in vitro demonstraram que baixas concentrações de sais de prata oxigenados são mais eficazes do que a prata iônica (Ag1+) contra bactérias patogênicas como Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus e Escherichia coli8,9. Outro novo tipo de curativo de prata inclui ingredientes adicionais, como o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e o cloreto de benzethônio (BC), que, segundo relatos, têm como alvo a matriz extracelular polimérica (EPS) do biofilme, aumentando assim a penetração da prata no biofilme. Essas novas tecnologias de prata oferecem novas maneiras de atingir biofilmes em feridas. No entanto, o impacto desses antimicrobianos no ambiente da ferida e na cicatrização independente de infecção é importante para garantir que eles não criem um ambiente desfavorável na ferida ou retardem a cicatrização. Preocupações com a citotoxicidade da prata in vitro foram relatadas com vários curativos de prata10,11. Contudo, a citotoxicidade in vitro ainda não se traduziu em toxicidade in vivo, e vários curativos de Ag1+ demonstraram um bom perfil de segurança12.
Neste estudo, investigamos a eficácia de curativos de carboximetilcelulose contendo novas formulações de prata contra biofilme em feridas, in vitro e in vivo. Além disso, avaliamos os efeitos desses curativos nas respostas imunes e na cicatrização, independentemente da infecção.
Todos os curativos utilizados estavam disponíveis comercialmente. O curativo de fibra em gel 3M Kerracel (3M, Knutsford, Reino Unido) é um curativo de fibra em gel 100% carboximetilcelulose (CMC) não antimicrobiano, utilizado como controle neste estudo. Três curativos antimicrobianos de prata com CMC foram avaliados, sendo eles o curativo 3M Kerracel Ag (3M, Knutsford, Reino Unido), que contém 1,7% em peso de sal de prata oxigenado (Ag7NO11) em íons de prata de valência superior (Ag1+, Ag2+ e Ag3+). Durante a decomposição do Ag7NO11, os íons Ag1+, Ag2+ e Ag3+ são formados na proporção de 1:2:4. Curativo Aquacel Ag Extra contendo 1,2% de cloreto de prata (Ag1+) (ConvaTec, Deeside, Reino Unido) 13 e curativo Aquacel Ag + Extra contendo 1,2% de cloreto de prata (Ag1+), EDTA e cloreto de benzethônio (ConvaTec, Deeside, Reino Unido) 14.
As cepas utilizadas neste estudo foram Pseudomonas aeruginosa NCTC 10781 (Public Health England, Salisbury) e Staphylococcus aureus NCTC 6571 (Public Health England, Salisbury).
As bactérias foram cultivadas durante a noite em caldo Muller-Hinton (Oxoid, Altrincham, Reino Unido). A cultura noturna foi então diluída 1:100 em caldo Muller-Hinton e 200 µl foram semeados em membranas estéreis de 0,2 µm Whatman Cyclopore (Whatman plc, Maidstone, Reino Unido) sobre placas de ágar Muller-Hinton (Sigma-Aldrich Company Ltd, Kent, Grã-Bretanha). A formação de biofilme colonial foi avaliada a 37 °C por 24 horas. Esses biofilmes coloniais foram testados quanto à retração logarítmica.
Corte o curativo em pedaços quadrados de 3 cm² e umedeça-os previamente com água deionizada estéril. Coloque o curativo sobre o biofilme da colônia na placa de ágar. A cada 24 horas, o biofilme era removido e as bactérias viáveis dentro do biofilme (UFC/ml) eram quantificadas por diluição seriada (10⁻¹ a 10⁻⁷) em caldo de neutralização Day-Angle (Merck-Millipore). Após 24 horas de incubação a 37 °C, foram realizadas contagens celulares padrão em placas de ágar Mueller-Hinton. Cada tratamento e ponto de tempo foi realizado em triplicata, e as contagens celulares foram repetidas para cada diluição.
A pele da barriga de porco foi obtida de porcas da raça Large White em até 15 minutos após o abate, de acordo com as normas de exportação da União Europeia. A pele foi raspada e limpa com lenços umedecidos em álcool, sendo então congelada a -80°C por 24 horas para desvitalizá-la. Após o descongelamento, pedaços de pele de 1 cm² foram lavados três vezes com PBS, hipoclorito de sódio a 0,6% e etanol a 70%, durante 20 minutos cada vez. Antes da remoção da epiderme, qualquer resíduo de etanol foi removido lavando-se três vezes com PBS estéril. A pele foi cultivada em uma placa de 6 poços com uma membrana de náilon de 0,45 μm de espessura (Merck-Millipore) sobreposta e três discos absorventes (Merck-Millipore) contendo 3 ml de soro fetal bovino (Sigma) suplementado com 10% de meio de cultura Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM – Aldrich Ltd.).
Biofilmes coloniais foram cultivados conforme descrito para os estudos de exposição a biofilmes. Após o cultivo do biofilme na membrana por 72 horas, o biofilme foi aplicado na superfície da pele utilizando uma alça de inoculação estéril e a membrana foi removida. O biofilme foi então incubado na derme do suíno por mais 24 horas a 37 °C para permitir sua maturação e adesão à pele. Após a maturação e adesão do biofilme, um curativo de 1,5 cm², previamente umedecido com água destilada estéril, foi aplicado diretamente na superfície da pele e incubado a 37 °C por 24 horas. As bactérias viáveis foram visualizadas por coloração, aplicando-se uniformemente o reagente de viabilidade celular PrestoBlue (Invitrogen, Life Technologies, Paisley, Reino Unido) na superfície apical de cada explante e incubando-o por 5 minutos. As imagens foram capturadas instantaneamente no microscópio Leica MZ8 utilizando a câmera digital Leica DFC425. As áreas coloridas em rosa foram quantificadas usando o software Image Pro versão 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD Image-Pro (mediacy.com)). A microscopia eletrônica de varredura foi realizada conforme descrito abaixo.
As bactérias cultivadas durante a noite foram diluídas 1:100 em caldo Mueller-Hinton. 200 μl da cultura foram adicionados a uma membrana estéril de 0,2 μm Whatman Cyclopore (Whatman, Maidstone, Reino Unido) e semeados em ágar Mueller-Hinton. As placas de biofilme foram incubadas a 37 °C por 72 horas para permitir a formação de biofilme maduro.
Após 3 dias de maturação do biofilme, um curativo quadrado de 3 cm² foi colocado diretamente sobre o biofilme e incubado a 37 °C por 24 horas. Após a remoção do curativo da superfície do biofilme, 1 ml do reagente de viabilidade celular PrestoBlue (Invitrogen, Waltham, MA) foi adicionado à superfície de cada biofilme por 20 segundos. As superfícies foram secas antes que as alterações de cor fossem registradas usando uma câmera digital Nikon D2300 (Nikon UK Ltd., Kingston, Reino Unido).
Prepare culturas noturnas em ágar Mueller-Hinton, transfira colônias individuais para 10 ml de caldo Mueller-Hinton e incube em agitador a 37 °C (100 rpm). Após a incubação noturna, a cultura foi diluída 1:100 em caldo Mueller-Hinton e 300 µl foram aplicados em uma membrana circular Whatman Cyclopore de 0,2 µm (Whatman International, Maidstone, Reino Unido) sobre ágar Mueller-Hinton e incubados a 37 °C por até 72 horas. O biofilme maduro foi aplicado na ferida conforme descrito abaixo.
Todo o trabalho com animais foi realizado na Universidade de Manchester sob uma licença de projeto aprovada pelo Escritório de Bem-Estar Animal e Revisão Ética (P8721BD27) e de acordo com as diretrizes publicadas pelo Ministério do Interior sob a ASPA revisada de 2012. Todos os autores seguiram as diretrizes de chegada. Camundongos C57BL/6j de oito semanas de idade (Envigo, Oxon, Reino Unido) foram usados para todos os estudos in vivo. Os camundongos foram anestesiados com isoflurano (Piramal Critical Care Ltd, West Drayton, Reino Unido) e suas superfícies dorsais foram raspadas e limpas. Em seguida, cada camundongo recebeu uma ferida excisional de 2 × 6 mm usando um punch de biópsia de Stiefel (Schuco International, Hertfordshire, Reino Unido). Para feridas infectadas por biofilme, aplicou-se biofilme colonial de 72 horas cultivado na membrana, conforme descrito acima, na camada dérmica da ferida usando uma alça de inoculação estéril imediatamente após a lesão e descartou-se a membrana. Um centímetro quadrado de curativo é pré-umedecido com água estéril para manter um ambiente úmido na ferida. Os curativos foram aplicados diretamente em cada ferida e cobertos com filme 3M Tegaderm (3M, Bracknell, Reino Unido) e adesivo líquido Mastisol (Eloquest Healthcare, Ferndale, MI) aplicado ao redor das bordas para proporcionar adesão adicional. Buprenorfina (Animalcare, York, Reino Unido) foi administrada na concentração de 0,1 mg/kg como analgésico. Os camundongos foram sacrificados três dias após a lesão, utilizando o método do Esquema 1, e a área da ferida foi removida, dividida ao meio e armazenada conforme necessário.
A coloração com hematoxilina (ThermoFisher Scientific) e eosina (ThermoFisher Scientific) foi realizada de acordo com o protocolo do fabricante. A área da ferida e a reepitelização foram quantificadas utilizando o software Image Pro versão 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD).
Os cortes de tecido foram desparafinados em xileno (ThermoFisher Scientific, Loughborough, Reino Unido), reidratados com etanol em concentrações crescentes de 100 a 50% e brevemente imersos em água deionizada (ThermoFisher Scientific). A imuno-histoquímica foi realizada utilizando o kit VectaStain Elite ABC PK-6104 (Vector Laboratories, Burlingame, CA) de acordo com o protocolo do fabricante. Os anticorpos primários para neutrófilos NIMP-R14 (Thermofisher Scientific) e macrófagos Ms CD107b Pure M3/84 (BD Biosciences, Wokingham, Reino Unido) foram diluídos a 1:100 em solução bloqueadora e adicionados à superfície de corte, seguidos por dois anticorpos anti-Vectasina ABC e o kit de substrato Vector Nova Red Peroxidase (HRP) (Vector Laboratories, Burlingame, CA), com contracoloração em hematoxilina. As imagens foram adquiridas utilizando um microscópio Olympus BX43 e uma câmera digital Olympus DP73 (Olympus, Southend-on-Sea, Reino Unido).
Amostras de pele foram fixadas em glutaraldeído a 2,5% e formaldeído a 4% em HEPES 0,1 M (pH 7,4) por 24 horas a 4 °C. As amostras foram desidratadas com etanol em concentrações crescentes e secas em CO₂ utilizando um secador de ponto crítico Quorum K850 (Quorum Technologies Ltd, Loughton, Reino Unido) e revestidas com liga de ouro-paládio por pulverização catódica utilizando um sistema de pulverização catódica/descarga luminescente Quorum SC7620. As amostras foram imagiadas utilizando um microscópio eletrônico de varredura FEI Quanta 250 (ThermoFisher Scientific) para visualizar o ponto central da ferida.
O iodeto de Toto-1 (2 μM) foi aplicado na superfície da ferida excisada do camundongo e incubado por 5 minutos a 37 °C (ThermoFisher Scientific) e tratado com Syto-60 (10 μM) a 37 °C (ThermoFisher Scientific). Imagens de pilha Z de 15 minutos foram criadas usando um Leica TCS SP8.
Os dados das réplicas biológicas e técnicas foram tabulados e analisados utilizando o software GraphPad Prism V9 (GraphPad Software, La Jolla, CA). A análise de variância unidirecional com comparações múltiplas, utilizando o teste post hoc de Dunnett, foi usada para verificar as diferenças entre cada tratamento e o curativo controle não antimicrobiano. Um valor de p < 0,05 foi considerado significativo.
A eficácia de curativos fibrosos com gel de prata foi avaliada inicialmente contra colônias de biofilme de Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa in vitro. Os curativos de prata contêm diferentes formulações de prata: curativos de prata tradicionais produzem íons Ag1+; curativos de prata que, após a adição de EDTA/BC, podem produzir íons Ag1+, destroem a matriz do biofilme e expõem as bactérias à prata sob o efeito antibacteriano da prata; e curativos contendo sais de prata oxigenados que produzem íons Ag1+, Ag2+ e Ag3+. Sua eficácia foi comparada com um curativo controle não antimicrobiano feito de fibras gelificadas. As bactérias viáveis remanescentes dentro do biofilme foram avaliadas a cada 24 horas durante 8 dias (Figura 1). No 5º dia, o biofilme foi reinoculado com 3,85 × 105 S. Staphylococcus aureus ou 1,22 × 105 P. aeruginosa para avaliar a recuperação do biofilme. Em comparação com curativos de controle não antimicrobianos, os curativos com Ag1+ tiveram efeito mínimo na viabilidade bacteriana em biofilmes de Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa ao longo de 5 dias. Em contraste, curativos contendo Ag oxigenado e sais de Ag1+ + EDTA/BC foram eficazes na eliminação de bactérias dentro do biofilme em 5 dias. Após inoculação repetida com bactérias planctônicas no 5º dia, não foi observada restauração do biofilme (Fig. 1).
Quantificação de bactérias viáveis em biofilmes de Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa após tratamento com curativos de prata. Colônias de biofilme de Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa foram tratadas com curativos de prata ou curativos controle não antimicrobianos, e o número de bactérias viáveis remanescentes foi determinado a cada 24 horas. Após 5 dias, o biofilme foi reinoculado com 3,85×10⁵ colônias de Staphylococcus aureus ou 1,22×10⁵ colônias do bacterioplâncton Pseudomonas aeruginosa foram formadas individualmente para avaliar a recuperação do biofilme. Os gráficos mostram a média ± erro padrão.
Para visualizar o efeito dos curativos de prata na viabilidade do biofilme, os curativos foram aplicados em biofilmes maduros cultivados em pele suína ex vivo. Após 24 horas, o curativo foi removido e o biofilme foi corado com um corante reativo azul, que é metabolizado por bactérias vivas, resultando em uma coloração rosa. Os biofilmes tratados com curativos controle apresentaram coloração rosa, indicando a presença de bactérias viáveis em seu interior (Figura 2A). Em contraste, o biofilme tratado com o curativo de oxissolos de prata apresentou coloração predominantemente azul, indicando que as bactérias remanescentes na superfície da pele do suíno eram não viáveis (Figura 2B). Uma coloração mista azul e rosa foi observada nos biofilmes tratados com curativos contendo Ag1+, indicando a presença de bactérias viáveis e não viáveis em seu interior (Figura 2C), enquanto os curativos de EDTA/BC contendo Ag1+ apresentaram coloração predominantemente azul com algumas manchas rosas, indicando áreas não afetadas pelo curativo de prata (Figura 2D). A quantificação das áreas ativas (rosa) e inativas (azul) mostrou que o curativo controle apresentou 75% de atividade (Figura 2E). Os curativos Ag1+ + EDTA/BC apresentaram desempenho semelhante aos curativos com sais de prata oxigenados, com taxas de sobrevivência de 13% e 14%, respectivamente. O curativo Ag1+ também reduziu a viabilidade bacteriana em 21%. Esses biofilmes foram então observados por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Após o tratamento com o curativo controle e o curativo Ag1+, observou-se uma camada de Pseudomonas aeruginosa cobrindo a pele suína (Figura 2F,H), enquanto que, após o tratamento com o curativo Ag1+, poucas células bacterianas foram encontradas, inclusive abaixo da camada de fibras de colágeno. As fibras de colágeno podem ser consideradas a estrutura tecidual da pele suína (Figura 2G). Após o tratamento com o curativo Ag1+ + EDTA/BC, placas bacterianas e placas de fibras de colágeno subjacentes tornaram-se visíveis (Figura 2I).
Visualização do biofilme de Pseudomonas aeruginosa após tratamento com curativo de prata. (A–D) A viabilidade bacteriana em biofilmes de Pseudomonas aeruginosa cultivados em pele suína foi visualizada usando o corante de viabilidade PrestoBlue 24 horas após o tratamento com curativos de prata ou curativos controle não antimicrobianos. Bactérias vivas são representadas em rosa, bactérias não viáveis e pele suína em azul. (E) Quantificação de biofilmes de Pseudomonas aeruginosa cultivados em pele suína (ponto rosa) usando microscopia eletrônica de varredura Image Pro versão 10 (FI) e tratados com um curativo de prata ou um curativo controle não antimicrobiano por 24 horas. Barra de escala MEV = 5 µm. (J–M) Biofilmes coloniais cresceram em filtros e foram corados com o corante reativo PrestoBlue após 24 h de incubação com curativos de prata.
Para determinar se o contato próximo entre os curativos e os biofilmes afetava a eficácia dos curativos, biofilmes coloniais colocados em uma superfície plana foram tratados com os curativos por 24 horas e, em seguida, corados com corantes reativos. O biofilme não tratado apresentava coloração rosa escura (Figura 2J). Em contraste com os biofilmes tratados com curativos contendo sais de prata oxigenados (Figura 2K), os biofilmes tratados com curativos contendo Ag1+ ou Ag1+ + EDTA/BC apresentaram faixas de coloração rosa (Figura 2L,M). Essa coloração rosa indica a presença de bactérias viáveis e está associada à área de sutura dentro do curativo. Essas áreas suturadas criam espaços mortos que permitem a sobrevivência das bactérias dentro do biofilme.
Para avaliar a eficácia dos curativos de prata in vivo, feridas excisadas de espessura total em camundongos infectados com biofilmes maduros de S. aureus e P. aeruginosa foram tratadas com curativos controle não antimicrobianos ou com curativos de prata. Após 3 dias de tratamento, a análise macroscópica de imagens mostrou feridas menores quando tratadas com curativos de solução salina oxigenada em comparação com os curativos controle não antimicrobianos e os demais curativos de prata (Figura 3A-H). Para confirmar essas observações, as feridas foram coletadas e a área da ferida e a reepitelização foram quantificadas em cortes de tecido corados com hematoxilina e eosina, utilizando o software Image Pro versão 10 (Figura 3I-L).
Efeito de curativos de prata na superfície da ferida e na reepitelização de feridas infectadas com biofilmes. (A–H) Pequenas células infectadas com biofilmes de Pseudomonas aeruginosa (A–D) e Staphylococcus aureus (E–H) após três dias de tratamento com um curativo controle não antimicrobiano, um curativo com sal de prata oxigenado, um curativo com Ag1+ e um curativo com Ag1+. Imagens macroscópicas representativas. Feridas de camundongos com curativo Ag1+ + EDTA/BC. (IL) Infecção representativa por Pseudomonas aeruginosa, cortes histológicos corados com hematoxilina e eosina, usados para quantificar a área da ferida e a regeneração epitelial. Quantificação da área da ferida (M, O) e porcentagem de reepitelização (N, P) de feridas infectadas com biofilmes de Pseudomonas aeruginosa (M, N) e Staphylococcus aureus (O, P) (por grupo de tratamento n = 12). Os gráficos mostram a média ± erro padrão. * significa p < 0,05; ** significa p < 0,01; Escala macroscópica = 2,5 mm, escala histológica = 500 µm.
A quantificação da área da ferida em feridas infectadas com biofilme de Pseudomonas aeruginosa (Figura 3M) mostrou que as feridas tratadas com sais de prata apresentaram um tamanho médio de 2,5 mm², enquanto o curativo controle não antimicrobiano apresentou um tamanho médio de 3,1 mm², o que não atingiu significância estatística (Figura 3M; p = 0,423). As feridas tratadas com Ag1+ ou Ag1+ + EDTA/BC não apresentaram redução na área da ferida (3,1 mm² e 3,6 mm², respectivamente). O tratamento com curativo de sais de prata oxigenados promoveu a reepitelização em maior extensão do que o curativo controle não antimicrobiano (34% e 15%, respectivamente; p = 0,029) e Ag1+ ou Ag1+ + EDTA/BC (10% e 11%, respectivamente) (Figura 3N).
Tendências semelhantes na área da ferida e na regeneração epitelial foram observadas em feridas infectadas com biofilmes de S. aureus (Figura 3O). Curativos contendo sais de prata oxigenados reduziram a área da ferida (2,0 mm²) em 23% em comparação com o curativo controle não antimicrobiano (2,6 mm²), embora essa redução não tenha sido significativa (p = 0,304) (Figura 3O). Além disso, a área da ferida no grupo tratado com Ag1+ foi ligeiramente reduzida (2,4 mm²), enquanto a ferida tratada com o curativo Ag1+ + EDTA/BC não apresentou redução na área (2,9 mm²). Os sais de prata oxigenados também promoveram a reepitelização de feridas infectadas com biofilme de S. aureus (31%) em maior extensão do que aquelas tratadas com curativos controle não antimicrobianos (12%, p = 0,003) (Figura 3P). O curativo Ag1+ (16%, p = 0,903) e o curativo Ag+1 + EDTA/BC (14%, p = 0,965) apresentaram níveis de regeneração epitelial semelhantes ao controle.
Para visualizar o efeito dos curativos de prata na matriz do biofilme, foi realizada a coloração com iodeto de Toto 1 e Syto 60 (Fig. 4). O iodeto de Toto 1 é um corante impermeável à célula que pode ser usado para visualizar com precisão os ácidos nucleicos extracelulares, que são abundantes na matriz extracelular polimérica (MEP) dos biofilmes. O Syto 60 é um corante permeável à célula usado como contracorante¹⁶. Observações com iodeto de Toto 1 e Syto 60 em feridas inoculadas com biofilmes de Pseudomonas aeruginosa (Figura 4A-D) e Staphylococcus aureus (Figura 4I-L) mostraram que, após 3 dias de tratamento com curativo, a MEP no biofilme foi significativamente reduzida. Os curativos Ag1+ sem componentes antibiofilme adicionais reduziram significativamente o DNA livre de células em feridas inoculadas com Pseudomonas aeruginosa, mas foram menos eficazes em feridas inoculadas com Staphylococcus aureus.
Imagens in vivo do biofilme da ferida após 3 dias de tratamento com curativos controle ou com prata. Imagens de microscopia confocal de Pseudomonas aeruginosa (A–D) e Staphylococcus aureus (I–L) coradas com Toto 1 (verde) para visualizar os ácidos nucleicos extracelulares, um componente dos polímeros do biofilme extracelular. Para corar os ácidos nucleicos intracelulares, utilize Syto 60 (vermelho). Microscopia eletrônica de varredura (MEV) de feridas infectadas com biofilmes de Pseudomonas aeruginosa (E–H) e Staphylococcus aureus (M–P) após 3 dias de tratamento com curativos controle e com prata. Barra de escala da MEV = 5 µm. Barra de escala da imagem confocal = 50 µm.
A microscopia eletrônica de varredura mostrou que os camundongos inoculados com colônias de biofilme de Pseudomonas aeruginosa (Figura 4E-H) e Staphylococcus aureus (Figura 4M-P) apresentaram uma quantidade significativamente menor de bactérias em suas feridas após 3 dias de tratamento com todos os curativos de prata.
Para avaliar o efeito de curativos de prata na inflamação de feridas em camundongos infectados por biofilme, seções de feridas infectadas por biofilme, tratadas com curativos controle ou com prata por 3 dias, foram submetidas a coloração imuno-histoquímica utilizando anticorpos específicos para neutrófilos e macrófagos. A determinação quantitativa de neutrófilos e macrófagos foi realizada internamente no tecido de granulação (Figura 5). Todos os curativos de prata reduziram o número de neutrófilos e macrófagos em feridas infectadas com Pseudomonas aeruginosa em comparação com os curativos controle não antimicrobianos após três dias de tratamento. No entanto, o tratamento com o curativo de sal de prata oxigenado resultou em uma redução maior de neutrófilos (p < 0,0001) e macrófagos (p < 0,0001) em comparação com os outros curativos de prata testados (Figura 5I,J). Embora o curativo Ag1+ + EDTA/BC tenha apresentado um efeito maior sobre o biofilme da ferida, ele reduziu os níveis de neutrófilos e macrófagos em menor grau do que o curativo Ag1+. Feridas moderadas infectadas com biofilme de S. aureus também foram observadas após curativos com oxissolos de Ag (p < 0,0001), Ag1+ (p = 0,0008) e Ag1++ EDTA/BC (p = 0,0043) em comparação com o controle. Tendências semelhantes foram observadas para neutropenia. curativo (Fig. 5K). No entanto, apenas o curativo com sal de Ag oxigenado mostrou uma redução significativa no número de macrófagos no tecido de granulação em comparação com o controle em feridas infectadas com biofilmes de S. aureus (p = 0,0339) (Figura 5L).
Neutrófilos e macrófagos foram quantificados em feridas infectadas com biofilmes de Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus após 3 dias de tratamento com curativo controle não antimicrobiano ou com curativos de prata. Neutrófilos (AD) e macrófagos (EH) foram quantificados em cortes de tecido corados com anticorpos específicos para neutrófilos ou macrófagos. Quantificação de neutrófilos (I e K) e macrófagos (J e L) em feridas infectadas com biofilmes de Pseudomonas aeruginosa (I e J) e Staphylococcus aureus (K e L). N = 12 por grupo. Os gráficos mostram a média ± erro padrão, com valores de significância comparados ao curativo controle não antibacteriano. * significa p < 0,05; ** significa p < 0,01; *** significa p < 0,001; indica p < 0,0001.
Em seguida, avaliamos o efeito dos curativos de prata na cicatrização independente de infecção. Feridas excisionais não infectadas foram tratadas com um curativo controle não antimicrobiano ou com um curativo de prata por 3 dias (Figura 6). Entre os curativos de prata testados, apenas as feridas tratadas com o curativo de sal oxigenado apresentaram tamanho menor nas imagens macroscópicas em comparação com as feridas tratadas com o controle (Figura 6A-D). A quantificação da área da ferida por meio de análise histológica mostrou que a área média da ferida após o tratamento com o curativo de oxissolos de prata foi de 2,35 mm², em comparação com 2,96 mm² para as feridas tratadas com o grupo controle, mas essa diferença não atingiu significância estatística (p = 0,488) (Figura 6I). Em contraste, nenhuma redução na área da ferida foi observada após o tratamento com os curativos Ag1+ (3,38 mm², p = 0,757) ou Ag1+ + EDTA/BC (4,18 mm², p = 0,054) em comparação com o grupo controle. Observou-se aumento na regeneração epitelial com o curativo de oxissol de prata em comparação ao grupo controle (30% vs. 22%, respectivamente), embora essa diferença não tenha atingido significância estatística (p = 0,067), sendo bastante significativa e confirmando resultados anteriores. Um curativo com oxissóis promove a reepitelização. -Epitelização de feridas não infectadas17. Em contraste, o tratamento com curativos de Ag1+ ou Ag1+ + EDTA/BC não apresentou efeito ou demonstrou diminuição da reepitelização em comparação ao controle.
Efeito do curativo de prata na cicatrização de feridas em camundongos não infectados com ressecção completa. (AD) Imagens macroscópicas representativas das feridas após três dias de tratamento com um curativo controle não antimicrobiano e um curativo de prata. (EH) Cortes histológicos representativos das feridas corados com hematoxilina e eosina. A quantificação da área da ferida (I) e a porcentagem de reepitelização (J) foram calculadas a partir de cortes histológicos no ponto médio da ferida usando software de análise de imagem (n = 11–12 por grupo de tratamento). Os gráficos mostram a média ± erro padrão. * significa p = <0,05.
A prata tem um longo histórico de uso como terapia antimicrobiana na cicatrização de feridas, mas as diversas formulações e métodos de administração podem resultar em diferenças na eficácia antimicrobiana18. Além disso, as propriedades antibiofilme de sistemas específicos de administração de prata não são totalmente compreendidas. Embora a resposta imune do hospedeiro seja relativamente eficaz contra bactérias planctônicas, ela geralmente é menos eficaz contra biofilmes19. As bactérias planctônicas são facilmente fagocitadas por macrófagos, mas, dentro dos biofilmes, as células agregadas representam problemas adicionais, limitando a resposta do hospedeiro a tal ponto que as células imunes podem sofrer apoptose e liberar fatores pró-inflamatórios para intensificar a resposta imune20. Observou-se que alguns leucócitos podem penetrar nos biofilmes21, mas são incapazes de fagocitar bactérias quando essa defesa está comprometida22. Uma abordagem holística deve ser utilizada para apoiar a resposta imune do hospedeiro contra a infecção por biofilme em feridas. O desbridamento da ferida pode romper fisicamente o biofilme e remover a maior parte da carga bacteriana, mas a resposta imune do hospedeiro pode ser ineficaz contra o biofilme remanescente, especialmente se estiver comprometida. Assim, terapias antimicrobianas, como curativos de prata, podem auxiliar a resposta imune do hospedeiro e eliminar infecções por biofilme. A composição, a concentração, a solubilidade e o substrato de liberação podem influenciar a eficácia antimicrobiana da prata. Nos últimos anos, os avanços na tecnologia de processamento da prata tornaram esses curativos mais eficazes9,23. À medida que a tecnologia de curativos de prata avança, é importante compreender a eficácia desses curativos no controle da infecção da ferida e, mais importante ainda, o impacto dessas formas potentes de prata no ambiente da ferida e na cicatrização.
Neste estudo, comparamos a eficácia de dois curativos de prata avançados com curativos de prata convencionais que produzem íons Ag1+ contra biofilmes, utilizando diferentes modelos in vitro e in vivo. Também avaliamos o efeito desses curativos no ambiente da ferida e na cicatrização independente de infecção. Para minimizar a influência da matriz de liberação, todos os curativos de prata testados foram compostos de carboximetilcelulose.
Nossa avaliação preliminar desses curativos de prata contra biofilmes coloniais de Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus mostra que, diferentemente dos curativos tradicionais de Ag1+, dois curativos de prata avançados, Ag1+ + EDTA/BC e sais de prata oxigenados, são eficazes na eliminação de bactérias do biofilme em poucos dias. Além disso, esses curativos previnem a reformação do biofilme após exposição repetida a bactérias planctônicas. O curativo de Ag1+ continha cloreto de prata, o mesmo composto de prata e matriz base que o Ag1+ + EDTA/BC, e teve um efeito limitado na viabilidade bacteriana dentro do biofilme durante o mesmo período. A observação de que um curativo de Ag1+ + EDTA/BC foi mais eficaz contra o biofilme do que um curativo de Ag1+ com a mesma matriz e um composto de prata reforça a noção de que ingredientes adicionais são necessários para aumentar a eficácia do cloreto de prata contra o biofilme, como já foi relatado em outros estudos15. Esses resultados corroboram a ideia de que a celulose bacteriana (BC) e o EDTA desempenham um papel adicional, contribuindo para a eficácia geral do curativo, e que a ausência desse componente nos curativos com Ag1+ pode ter contribuído para a falha em demonstrar eficácia in vitro. Descobrimos que os curativos com sais de prata oxigenados, que produzem íons Ag2+ e Ag3+, exibiram eficácia antibacteriana mais forte do que os curativos com Ag1+ e em níveis semelhantes aos de Ag1+ + EDTA/BC. No entanto, devido ao alto potencial redox, não está claro por quanto tempo os íons Ag3+ permanecem ativos e eficazes contra biofilmes em feridas, sendo, portanto, necessário um estudo mais aprofundado. Além disso, existem muitos outros curativos que geram íons Ag1+ que não foram testados neste estudo. Esses curativos são compostos por diferentes compostos de prata, concentrações e matrizes de base, o que pode influenciar a liberação de íons Ag1+ e sua eficácia contra biofilmes. Vale ressaltar também que existem muitos modelos in vitro e in vivo diferentes utilizados para avaliar a eficácia de curativos contra biofilmes. O tipo de modelo utilizado, bem como o teor de sal e proteína dos meios de cultura empregados nesses modelos, influenciarão a eficácia do curativo. Em nosso modelo in vivo, permitimos que o biofilme amadurecesse in vitro e, em seguida, o transferimos para a superfície dérmica da ferida. A resposta imune do camundongo hospedeiro é relativamente eficaz contra bactérias planctônicas aplicadas à ferida, formando assim um biofilme à medida que a ferida cicatriza. A adição de biofilme maduro a uma ferida limita a eficácia da resposta imune do hospedeiro à formação de biofilme, permitindo que o biofilme maduro se estabeleça dentro da ferida antes que a cicatrização possa começar. Assim, nosso modelo nos permite avaliar a eficácia de curativos antimicrobianos em biofilmes maduros antes que as feridas comecem a cicatrizar.
Também descobrimos que o ajuste do curativo influenciou a eficácia dos curativos de prata em biofilmes cultivados in vitro e na pele suína. O contato próximo com a ferida é considerado crucial para a eficácia antimicrobiana do curativo24,25. Curativos contendo sais de prata oxigenados estavam em contato próximo com biofilmes maduros, resultando em uma redução significativa no número de bactérias viáveis dentro do biofilme após 24 horas. Em contraste, quando tratados com curativos Ag1+ e Ag1+ + EDTA/BC, um número significativo de bactérias viáveis permaneceu. Esses curativos contêm suturas ao longo de todo o seu comprimento, o que cria espaços mortos que impedem o contato próximo com o biofilme. Em nossos estudos in vitro, essas áreas sem contato impediram a eliminação de bactérias viáveis dentro do biofilme. Avaliamos a viabilidade bacteriana apenas após 24 horas de tratamento; com o tempo, à medida que o curativo se torna mais saturado, pode haver menos espaço morto, reduzindo a área disponível para essas bactérias viáveis. No entanto, isso destaca a importância da composição do curativo, e não apenas do tipo de prata presente nele.
Embora estudos in vitro sejam úteis para comparar a eficácia de diferentes tecnologias de prata, também é importante compreender os efeitos desses curativos em biofilmes in vivo, onde o tecido hospedeiro e as respostas imunes contribuem para a eficácia dos curativos contra biofilmes. O efeito desses curativos em biofilmes de feridas foi observado por meio de microscopia eletrônica de varredura e coloração da matriz extracelular polimérica (EPS) do biofilme utilizando corantes de DNA intracelular e extracelular. Constatamos que, após 3 dias de tratamento, todos os curativos foram eficazes na redução do DNA livre de células em feridas infectadas por biofilme, mas o curativo Ag1+ foi menos eficaz em feridas infectadas por Staphylococcus aureus. A microscopia eletrônica de varredura também mostrou que havia significativamente menos bactérias presentes em feridas tratadas com os curativos de prata, embora isso tenha sido mais pronunciado com o curativo de sal de prata oxigenado e o curativo Ag1+ + EDTA/BC em comparação com o curativo Ag1+. Esses dados mostram que os curativos de prata testados tiveram diferentes graus de impacto na estrutura do biofilme, mas nenhum deles foi capaz de erradicá-lo, o que reforça a necessidade de uma abordagem holística para o tratamento de infecções por biofilme em feridas, como o uso de braçadeiras de prata. O tratamento é precedido por desbridamento físico para remover a maior parte do biofilme.
As feridas crônicas frequentemente se encontram em um estado de inflamação severa, com excesso de células inflamatórias permanecendo no tecido da ferida por um longo período, causando danos teciduais e esgotando o oxigênio necessário para o metabolismo e funcionamento celular eficientes na ferida26. Os biofilmes exacerbam esse ambiente hostil da ferida, afetando negativamente a cicatrização de diversas maneiras, incluindo a inibição da proliferação e migração celular e a ativação de citocinas pró-inflamatórias27. À medida que os curativos de prata se tornam mais eficazes, é importante compreender o impacto que eles têm no ambiente da ferida e na cicatrização.
Curiosamente, embora todos os curativos de prata tenham afetado a composição do biofilme, apenas os curativos com sais de prata oxigenados aumentaram a reepitelização dessas feridas infectadas. Esses dados corroboram nossas descobertas anteriores¹⁷ e as de Kalan et al. (2017)²⁸, que demonstraram bons perfis de segurança e toxicidade dos sais de prata oxigenados, visto que concentrações mais baixas de prata foram eficazes contra biofilmes.
Nosso estudo atual destaca as diferenças na tecnologia da prata entre curativos antimicrobianos de prata e o impacto dessa tecnologia no ambiente da ferida e na cicatrização independente de infecção. No entanto, esses resultados diferem de estudos anteriores que mostraram que o curativo Ag1+ + EDTA/BC melhorou os parâmetros de cicatrização de orelhas de coelho lesionadas in vivo. Contudo, isso pode ser devido a diferenças nos modelos animais, nos tempos de medição e nos métodos de aplicação bacteriana29. Neste caso, as medições da ferida foram feitas 12 dias após a lesão para permitir que os ingredientes ativos do curativo agissem no biofilme por um período mais longo. Isso é corroborado por um estudo que mostrou que úlceras de perna clinicamente infectadas tratadas com Ag1+ + EDTA/BC inicialmente aumentaram de tamanho após uma semana de tratamento e, em seguida, ao longo das 3 semanas seguintes de tratamento com Ag1+ + EDTA/BC e dentro de 4 semanas de uso de medicamentos não antimicrobianos. Curativos de CMC para reduzir o tamanho das úlceras30.
Certas formas e concentrações de prata demonstraram ser citotóxicas in vitro11, mas esses resultados in vitro nem sempre se traduzem em efeitos adversos in vivo. Além disso, os avanços na tecnologia da prata e uma melhor compreensão dos compostos e concentrações de prata em curativos levaram ao desenvolvimento de muitos curativos de prata seguros e eficazes. No entanto, à medida que a tecnologia de curativos de prata avança, é importante compreender o impacto desses curativos no ambiente da ferida31,32,33. Foi relatado anteriormente que o aumento na taxa de reepitelização corresponde a uma maior proporção de macrófagos M2 anti-inflamatórios em comparação com o fenótipo M1 pró-inflamatório. Isso foi observado em um modelo murino anterior, no qual curativos de hidrogel de prata foram comparados com sulfadiazina de prata e hidrogéis não antimicrobianos34.
Feridas crônicas podem apresentar inflamação excessiva e observou-se que a presença de excesso de neutrófilos pode ser prejudicial à cicatrização de feridas35. Em um estudo com camundongos com depleção de neutrófilos, a presença dessas células retardou a reepitelização. O excesso de neutrófilos leva a altos níveis de proteases e espécies reativas de oxigênio, como superóxido e peróxido de hidrogênio, que estão associadas a feridas crônicas e de cicatrização lenta37,38. Da mesma forma, um aumento no número de macrófagos, se não controlado, pode levar ao retardo da cicatrização de feridas39. Esse aumento é particularmente importante se os macrófagos forem incapazes de transitar de um fenótipo pró-inflamatório para um fenótipo pró-cicatrizante, resultando na incapacidade das feridas de saírem da fase inflamatória da cicatrização40. Observamos uma diminuição de neutrófilos e macrófagos em feridas infectadas por biofilme após 3 dias de tratamento com todos os curativos de prata, mas a diminuição foi mais pronunciada com os curativos de sal oxigenado. Essa diminuição pode ser um resultado direto da resposta imune à prata, uma resposta à redução da carga bacteriana ou o fato de a ferida estar em um estágio mais avançado de cicatrização e, portanto, com redução das células imunes na ferida. A redução do número de células inflamatórias na ferida pode manter um ambiente propício à cicatrização. O mecanismo de ação pelo qual os oxissais de prata promovem a cicatrização independente de infecção não está claro, mas a capacidade dos oxissais de prata de produzir oxigênio e destruir níveis nocivos de peróxido de hidrogênio, um mediador da inflamação, pode explicar isso e requer estudos adicionais.17
Feridas crônicas infectadas que não cicatrizam representam um problema tanto para médicos quanto para pacientes. Embora muitos curativos aleguem eficácia antimicrobiana, as pesquisas raramente se concentram em outros fatores-chave que influenciam o microambiente da ferida. Este estudo demonstra que diferentes tecnologias de prata apresentam eficácia antimicrobiana distinta e, principalmente, efeitos diferentes no ambiente da ferida e na cicatrização, independentemente da infecção. Embora esses estudos in vitro e in vivo demonstrem a eficácia desses curativos no tratamento de infecções de feridas e na promoção da cicatrização, ensaios clínicos randomizados e controlados são necessários para avaliar a eficácia desses curativos na prática clínica.
Os conjuntos de dados utilizados e/ou analisados durante o presente estudo estão disponíveis mediante solicitação razoável ao autor correspondente.
Data da publicação: 15 de julho de 2024