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Núcleo autólogo Pulposus implantado em osso subcondral lombar para criar um modelo animal de alterações módicas

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O estabelecimento de modelos animais de mudança modic (MC) é uma base importante para o estudo do MC. Cinqüenta e quatro coelhos brancos da Nova Zelândia foram divididos em grupo de operação simulada, grupo de implantação muscular (grupo ME) e grupo de implantação do núcleo pulposo (grupo NPE). No grupo NPE, o disco intervertebral foi exposto por abordagem cirúrgica lombar anterolateral e uma agulha foi usada para perfurar o corpo vertebral L5 próximo à placa final. O NP foi extraído do disco intervertebral L1/2 por uma seringa e injetado nela. Perfurando um buraco no osso subcondral. Os procedimentos cirúrgicos e os métodos de perfuração no grupo de implantação muscular e no grupo de operação simulada foram os mesmos do grupo de implantação de NP. No grupo ME, um pedaço de músculo foi colocado no buraco, enquanto no grupo de operação simulada, nada foi colocado no buraco. Após a operação, foram realizados varredura de ressonância magnética e testes biológicos moleculares. O sinal no grupo NPE mudou, mas não houve mudança de sinal óbvio no grupo de operação simulada e no grupo ME. A observação histológica mostrou que a proliferação anormal do tecido foi observada no local da implantação, e a expressão de IL-4, IL-17 e IFN-γ foi aumentada no grupo NPE. A implantação de NP no osso subcondral pode formar um modelo animal de MC.
As alterações módicas (MC) são lesões das placas finais vertebrais e medula óssea adjacente visíveis na ressonância magnética (RM). Eles são bastante comuns em indivíduos com sintomas associados1. Muitos estudos enfatizaram a importância do MC devido à sua associação com dor lombar (LBP) 2,3. De Roos et al.4 e Modic et al.5 descreveram independentemente três tipos diferentes de anormalidades de sinal subcondral na medula óssea vertebral. As alterações do tipo I é hipointense nas sequências ponderadas em T1 (T1W) e hiperintensidade nas sequências ponderadas em T2 (T2W). Esta lesão revela placas finais da fissura e tecido de granulação vascular adjacente na medula óssea. As alterações do tipo II do tipo II mostram alto sinal nas sequências T1W e T2W. Nesse tipo de lesão, a destruição da placa final pode ser encontrada, bem como a substituição histológica da medula óssea adjacente. As alterações do tipo III mostram sinal baixo nas sequências T1W e T2W. Lesões escleróticas correspondentes às placas finais foram observadas6. O MC é considerado uma doença patológica da coluna vertebral e está intimamente associada a muitas doenças degenerativas da espinha 7,8,9.
Considerando os dados disponíveis, vários estudos forneceram informações detalhadas sobre a etiologia e os mecanismos patológicos do MC. Albert et al. sugeriu que o MC pode ser causado pela hérnia de disco8. Hu et al. MC atribuído à degeneração grave do disco10. A KROC propôs o conceito de "ruptura interna do disco", que afirma que o trauma de disco repetitivo pode levar a microteares na placa final. Após a formação de fendas, a destruição da placa final pelo núcleo pulposo (NP) pode desencadear uma resposta autoimune, o que leva ainda ao desenvolvimento do MC11. Ma et al. compartilhou uma visão semelhante e relatou que a autoimunidade induzida por NP desempenha um papel fundamental na patogênese do MC12.
As células do sistema imunológico, especialmente os linfócitos auxiliares CD4+ T, desempenham um papel crítico na patogênese da autoimunidade13. O subconjunto Th17 recentemente descoberto produz a citocina pró-inflamatória IL-17, promove a expressão de quimiocina e estimula células T em órgãos danificados a produzir IFN-γ14. As células Th2 também desempenham um papel único na patogênese das respostas imunes. A expressão de IL-4 como uma célula Th2 representativa pode levar a graves conseqüências imunopatológicas15.
Embora muitos estudos clínicos tenham sido realizados em MC16,17,18,19,20,21,22,23,24, ainda há uma falta de modelos experimentais de animais adequados que podem imitar o processo de MC que ocorre frequentemente em humanos e pode ser usado para investigar a etiologia ou novos tratamentos, como terapia direcionada. Até o momento, foram relatados apenas alguns modelos animais de MC para estudar os mecanismos patológicos subjacentes.
Com base na teoria auto -imune proposta por Albert e MA, este estudo estabeleceu um modelo de MC de coelho simples e reproduzível ao NP autotransplante próximo à placa final vertebral perfurada. Outros objetivos são observar as características histológicas dos modelos animais e avaliar os mecanismos específicos de NP no desenvolvimento do MC. Para esse fim, usamos técnicas como biologia molecular, ressonância magnética e estudos histológicos para estudar a progressão do MC.
Dois coelhos morreram de sangramento durante a cirurgia e quatro coelhos morreram durante a anestesia durante a ressonância magnética. Os 48 coelhos restantes sobreviveram e não mostraram sinais comportamentais ou neurológicos após a cirurgia.
A ressonância magnética mostra que a intensidade do sinal do tecido incorporado em diferentes orifícios é diferente. A intensidade do sinal do corpo vertebral L5 no grupo NPE mudou gradualmente às 12, 16 e 20 semanas após a inserção (a sequência de T1W mostrou sinal baixo, e a sequência T2W mostrou sinal misto mais sinal baixo) (Fig. 1C), enquanto as aparências de ressonância magnética Dos outros dois grupos de partes incorporadas permaneceram relativamente estáveis ​​durante o mesmo período (Fig. 1a, b).
(A) ressonância seqüencial representativa da coluna lombar de coelho em três momentos. Não foram encontradas anormalidades de sinal nas imagens do grupo de operação simulada. (B) As características do sinal do corpo vertebral no grupo ME são semelhantes às do grupo de operação simulada, e nenhuma mudança significativa de sinal é observada no local de incorporação ao longo do tempo. (C) No grupo NPE, o sinal baixo é claramente visível na sequência T1W, e o sinal misto e o sinal baixo são claramente visíveis na sequência T2W. Do período de 12 semanas até o período de 20 semanas, os altos sinais esporádicos ao redor dos sinais baixos na sequência T2W diminuem.
Hiperplasia óssea óbvia pode ser vista no local de implantação do corpo vertebral no grupo NPE, e a hiperplasia óssea ocorre mais rapidamente de 12 a 20 semanas (Fig. 2C) em comparação com o grupo NPE, nenhuma mudança significativa é observada no vertebral modelado corpos; Grupo Sham and Me Group (Fig. 2C) 2a, b).
(A) A superfície do corpo vertebral na porção implantada é muito lisa, o orifício cura bem, e não há hiperplasia no corpo vertebral. (B) A forma do local implantada no grupo ME é semelhante ao do grupo de operação simulado, e não há mudança óbvia na aparência do local implantado ao longo do tempo. (C) ocorreu hiperplasia óssea no local implantado no grupo NPE. A hiperplasia óssea aumentou rapidamente e até se estendeu através do disco intervertebral para o corpo vertebral contralateral.
A análise histológica fornece informações mais detalhadas sobre a formação óssea. A Figura 3 mostra as fotografias das seções pós -operatórias coradas com H&E. No grupo de operação simulada, os condrócitos foram bem organizados e nenhuma proliferação celular foi detectada (Fig. 3A). A situação no grupo ME foi semelhante à do grupo de operação simulada (Fig. 3b). No entanto, no grupo NPE, um grande número de condrócitos e proliferação de células do tipo NP foram observadas no local da implantação (Fig. 3C);
(A) As trabéculas podem ser vistas perto da placa final, os condrócitos são organizados com o tamanho e a forma uniformes das células e sem proliferação (40 vezes). (B) A condição do local de implantação no grupo ME é semelhante à do grupo sham. Trabéculas e condrócitos podem ser vistos, mas não há proliferação óbvia no local de implantação (40 vezes). (B) Pode-se observar que condrócitos e células do tipo NP proliferam significativamente, e a forma e o tamanho dos condrócitos são desiguais (40 vezes).
A expressão do mRNA da interleucina 4 (IL-4), mRNA da interleucina 17 (IL-17) e mRNA de interferon γ (IFN-γ) foram observados nos grupos NPE e ME. Quando os níveis de expressão dos genes alvo foram comparados, as expressões genéticas de IL-4, IL-17 e IFN-γ aumentaram significativamente no grupo NPE em comparação com as do grupo ME e o grupo de operação simulado (Fig. 4) (P <0,05). Comparado com o grupo de operação simulada, os níveis de expressão de IL-4, IL-17 e IFN-γ no grupo ME aumentaram apenas ligeiramente e não atingiram a mudança estatística (p> 0,05).
A expressão de mRNA de IL-4, IL-17 e IFN-γ no grupo NPE mostrou uma tendência significativamente maior do que aqueles no grupo de operação simulada e no grupo ME (p <0,05).
Por outro lado, os níveis de expressão no grupo ME não mostraram diferença significativa (p> 0,05).
A análise de Western blot foi realizada usando anticorpos disponíveis comercialmente contra IL-4 e IL-17 para confirmar o padrão de expressão de mRNA alterado. Como mostrado nas Figuras 5a, B, em comparação com o grupo ME e o grupo de operação simulada, os níveis de proteína de IL-4 e IL-17 no grupo NPE aumentaram significativamente (p <0,05). Comparado com o grupo de operação simulada, os níveis de proteína de IL-4 e IL-17 no grupo ME também não alcançaram alterações estatisticamente significativas (p> 0,05).
(A) Os níveis de proteína de IL-4 e IL-17 no grupo NPE foram significativamente maiores do que os do grupo ME e do grupo placebo (p <0,05). (B) Histograma de Western blot.
Devido ao número limitado de amostras humanas obtidas durante a cirurgia, estudos claros e detalhados sobre a patogênese do MC são um pouco difíceis. Tentamos estabelecer um modelo animal de MC para estudar seus potenciais mecanismos patológicos. Ao mesmo tempo, avaliação radiológica, avaliação histológica e avaliação biológica molecular foram usadas para seguir o curso do MC induzido pelo autoenxerto de NP. Como resultado, o modelo de implantação de NP resultou em uma mudança gradual na intensidade do sinal dos momentos de 12 a 20 semanas (sinal baixo misto nas sequências T1W e baixo sinal nas seqüências T2W), indicando alterações de tecido e as histológicas e moleculares As avaliações biológicas confirmaram os resultados do estudo radiológico.
Os resultados deste experimento mostram que as alterações visuais e histológicas ocorreram no local da violação do corpo vertebral no grupo NPE. Ao mesmo tempo, a expressão dos genes IL-4, IL-17 e IFN-γ, bem como IL-4, IL-17 e IFN-γ, foram observados, indicando que a violação do tecido autólogo do núcleo pulposus no vertebral O corpo pode causar uma série de sinal e alterações morfológicas. É fácil descobrir que as características do sinal dos corpos vertebrais do modelo animal (sinal baixo na sequência T1W, sinal misto e baixo sinal na sequência T2W) são muito semelhantes aos das células vertebrais humanas, e as características da ressonância magnética também Confirme as observações da histologia e da anatomia bruta, ou seja, as alterações nas células corporais vertebrais são progressivas. Embora a resposta inflamatória causada pelo trauma agudo possa aparecer logo após a punção, os resultados da ressonância magnética mostraram que as mudanças progressivamente de sinal apareceram 12 semanas após a punção e persistiram até 20 semanas sem nenhum sinal de recuperação ou reversão das alterações de ressonância magnética. Esses resultados sugerem que o NP vertebral autólogo é um método confiável para estabelecer o MV progressivo em coelhos.
Esse modelo de punção requer habilidade, tempo e esforço cirúrgico adequados. Em experimentos preliminares, dissecção ou estimulação excessiva das estruturas ligamentares paravertebrais podem resultar na formação de osteófitos vertebrais. Deve -se tomar cuidado para não danificar ou irritar os discos adjacentes. Como a profundidade da penetração deve ser controlada para obter resultados consistentes e reproduzíveis, fabricamos manualmente um plugue cortando a bainha de uma agulha de 3 mm de comprimento. O uso deste plugue garante profundidade uniforme de perfuração no corpo vertebral. Em experimentos preliminares, três cirurgiões ortopédicos envolvidos na operação encontraram agulhas de bitola de 16 anos mais fáceis de trabalhar com agulhas de bitola de 18 ou outros métodos. Para evitar sangramentos excessivos durante a perfuração, segurar a agulha ainda por um tempo fornecerá um orifício de inserção mais adequado, sugerindo que um certo grau de MC pode ser controlado dessa maneira.
Embora muitos estudos tenham como alvo o MC, pouco se sabe sobre a etiologia e patogênese do MC25,26,27. Com base em nossos estudos anteriores, descobrimos que a autoimunidade desempenha um papel fundamental na ocorrência e desenvolvimento do MC12. Este estudo examinou a expressão quantitativa de IL-4, IL-17 e IFN-γ, que são as principais vias de diferenciação das células CD4+ após a estimulação do antígeno. Em nosso estudo, em comparação com o grupo negativo, o grupo NPE teve maior expressão de IL-4, IL-17 e IFN-γ, e os níveis de proteína de IL-4 e IL-17 também foram maiores.
Clinicamente, a expressão do mRNA de IL-17 é aumentada em células NP de pacientes com hérnia de disco28. Os níveis aumentados de expressão de IL-4 e IFN-γ também foram encontrados em um modelo agudo de hérnia de disco não compressivo em comparação com controles saudáveis29. A IL-17 desempenha um papel fundamental na inflamação, lesão tecidual em doenças autoimunes30 e aumenta a resposta imune ao IFN-γ31. Foram relatadas lesão tecidual mediada por IL-17 aprimorada nos camundongos MRL/LPR32 e camundongos suscetíveis à auto-imunidade33. A IL-4 pode inibir a expressão de citocinas pró-inflamatórias (como IL-1β e TNFα) e ativação de macrófagos34. Foi relatado que a expressão do mRNA da IL-4 foi diferente no grupo NPE em comparação com a IL-17 e o IFN-γ no mesmo momento; A expressão do mRNA de IFN-γ no grupo NPE foi significativamente maior que a dos outros grupos. Portanto, a produção de IFN-γ pode ser um mediador da resposta inflamatória induzida pela intercalação do NP. Estudos mostraram que o IFN-γ é produzido por vários tipos de células, incluindo células T do tipo 1 ativado, células matadoras naturais e macrófagos35,36, e é uma citocina pró-inflamatória essencial que promove respostas imunes37.
Este estudo sugere que a resposta autoimune pode estar envolvida na ocorrência e desenvolvimento de MC. Luoma et al. descobriram que as características do sinal do MC e NP proeminente são semelhantes na ressonância magnética, e ambos mostram alto sinal na sequência T2W38. Algumas citocinas foram confirmadas como intimamente associadas à ocorrência de MC, como a IL-139. Ma et al. sugeriu que a protrusão ascendente ou descendente do NP pode ter uma grande influência na ocorrência e desenvolvimento do MC12. Bobechko40 e Herzbein et al.41 relataram que o NP é um tecido imunotolerante que não pode entrar na circulação vascular desde o nascimento. As saliências do NP introduzem corpos estranhos no suprimento sanguíneo, mediando assim as reações auto -imunes locais42. As reações auto -imunes podem induzir um grande número de fatores imunes e, quando esses fatores são continuamente expostos aos tecidos, eles podem causar alterações na sinalização43. Neste estudo, a superexpressão de IL-4, IL-17 e IFN-γ são fatores imunes típicos, provando ainda mais a estreita relação entre NP e MCS44. Este modelo animal imita bem o avanço do NP e a entrada na placa final. Esse processo revelou ainda o impacto da autoimunidade no MC.
Como esperado, esse modelo animal nos fornece uma possível plataforma para estudar MC. No entanto, esse modelo ainda tem algumas limitações: primeiro, durante a fase de observação animal, alguns coelhos de estágio intermediário precisam ser sacrificados para testes histológicos e moleculares de biologia, para que alguns animais "caem fora de uso" ao longo do tempo. Em segundo lugar, embora três pontos no tempo estejam definidos neste estudo, infelizmente, apenas modelamos um tipo de MC (mudança de tipo I Modic Type I), por isso não é suficiente para representar o processo de desenvolvimento de doenças humanas, e mais pontos no tempo precisam ser definidos para observar melhor todas as mudanças de sinal. Em terceiro lugar, as alterações na estrutura do tecido podem realmente ser mostradas claramente pela coloração histológica, mas algumas técnicas especializadas podem revelar melhor as mudanças microestruturais nesse modelo. Por exemplo, microscopia de luz polarizada foi usada para analisar a formação de fibrocartilagem nos discos intervertebrais de coelho45. Os efeitos a longo prazo do NP no MC e na placa final requerem estudos adicionais.
Cinqüenta e quatro coelhos brancos da Nova Zelândia (Peso cerca de 2,5-3 kg, 3-3,5 meses de idade) foram divididos aleatoriamente em grupo de operação simulada, grupo de implantação muscular (grupo ME) e grupo de implantação radicular (grupo NPE). Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética do Hospital Tianjin, e os métodos experimentais foram realizados em estrita conformidade com as diretrizes aprovadas.
Algumas melhorias foram feitas com a técnica cirúrgica de S. Sobajima 46. Cada coelho foi colocado em uma posição de rescisão lateral e a superfície anterior de cinco discos intervertebrais lombares consecutivos (IVDs) foi exposta usando uma abordagem retroperitoneal posterolateral. Cada coelho recebeu anestesia geral (20% de uretano, 5 ml/kg através da veia da orelha). Uma incisão longitudinal da pele foi feita da borda inferior das costelas até a borda pélvica, 2 cm ventral aos músculos paravertebrais. A coluna anterolateral direita de L1 a L6 foi exposta por dissecção nítida e contundente do tecido subcutâneo sobrejacente, tecido retroperitoneal e músculos (Fig. 6A). O nível do disco foi determinado usando a borda pélvica como um marco anatômico para o nível do disco L5-L6. Use uma agulha de punção de calibre 16 para perfurar um orifício próximo à placa final da vértebra L5 a uma profundidade de 3 mm (Fig. 6b). Use uma seringa de 5 ml para aspirar o núcleo autólogo Pulposus no disco intervertebral L1-L2 (Fig. 6C). Remova o núcleo pulposo ou o músculo de acordo com os requisitos de cada grupo. Depois que o orifício é aprofundado, as suturas absorvíveis são colocadas na fáscia profunda, fáscia superficial e pele, tomando cuidado para não danificar o tecido periosteal do corpo vertebral durante a cirurgia.
(A) O disco L5 - L6 é exposto através de uma abordagem retroperitoneal posterolateral. (B) Use uma agulha de calibre 16 para perfurar um orifício perto da placa final L5. (C) MFs autólogos são colhidos.
A anestesia geral foi administrada com 20% de uretano (5 ml/kg) administrada pela veia da orelha, e as radiografias da coluna lombar foram repetidas às 12, 16 e 20 semanas após o operatório.
Os coelhos foram sacrificados por injeção intramuscular de cetamina (25,0 mg/kg) e pentobarbital intravenoso de sódio (1,2 g/kg) às 12, 16 e 20 semanas após a cirurgia. A coluna inteira foi removida para análise histológica e análise real foi realizada. Transcrição reversa quantitativa (RT-qPCR) e Western blotting foram usados ​​para detectar alterações nos fatores imunológicos.
Os exames de ressonância magnética foram realizados em coelhos usando um ímã clínico de 3,0 T (GE Medical Systems, Florence, SC) equipado com um receptor ortogonal de bobina de membros. Os coelhos foram anestesiados com 20% de uretano (5 ml/kg) através da veia da orelha e, em seguida, colocaram supino dentro do ímã com a região lombar centrada em uma bobina de superfície circular de 5 polegadas de diâmetro (GE Medical Systems). As imagens do localizador ponderado em T2 coronais (TR, 1445 ms; TE, 37 ms) foram adquiridas para definir a localização do disco lombar de L3-L4 a L5-L6. As fatias ponderadas em T2 do plano sagital foram adquiridas com as seguintes configurações: sequência rápida de eco-eco com um tempo de repetição (TR) de 2200 ms e um tempo de eco (TE) de 70 ms, matriz; campo visual de 260 e oito estímulos; A espessura de corte foi de 2 mm, a lacuna foi de 0,2 mm.
Depois que a última fotografia foi tirada e o último coelho foi morto, os discos de Sham, Muscle-embebeded e NP foram removidos para exame histológico. Os tecidos foram fixados em formalina tamponada neutra a 10% por 1 semana, descalcificados com ácido etilenodiaminetetraacético e parafina seccionados. Os blocos de tecido foram incorporados em parafina e cortados em seções sagitais (5 μm de espessura) usando um microtomo. As seções foram coradas com hematoxilina e eosina (H&E).
Depois de coletar os discos intervertebrais dos coelhos em cada grupo, o RNA total foi extraído usando uma coluna Uniq-10 (Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd., China) de acordo com as instruções do fabricante e um sistema de transcrição reversa improvisado (Promega Inc. , Madison, WI, EUA). A transcrição reversa foi realizada.
O RT-QPCR foi realizado usando um Prism 7300 (Applied Biosystems Inc., EUA) e SYBR Green Jump Start Taq Readymix (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. O volume da reação de PCR foi de 20 μl e continha 1,5 μl de cDNA diluído e 0,2 μm de cada iniciador. Os primers foram projetados pelo OligperFect Designer (Invitrogen, Valencia, CA) e fabricados pela Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd. (China) (Tabela 1). As seguintes condições de ciclagem térmica foram utilizadas: Etapa inicial de ativação da polimerase a 94 ° C por 2 min, depois 40 ciclos de 15 s cada a 94 ° C para desnaturação do modelo, recozimento por 1 min a 60 ° C, extensão e fluorescência. As medições foram realizadas por 1 min a 72 ° C. Todas as amostras foram amplificadas três vezes e o valor médio foi usado para análise RT-qPCR. Os dados de amplificação foram analisados ​​usando o FlexStation 3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA). A expressão do gene IL-4, IL-17 e IFN-γ foi normalizada para o controle endógeno (ACTB). Os níveis de expressão relativa do mRNA alvo foram calculados usando o método 2-ΔΔCT.
A proteína total foi extraída dos tecidos usando um homogeneizador de tecido em tampão de lise da RIPA (contendo um coquetel inibidor da protease e fosfatase) e depois centrifugou a 13.000 rpm por 20 min a 4 ° C para remover os detritos do tecido. Cinqüenta microgramas de proteína foram carregados por faixa, separados por 10% de SDS-PAGE e depois transferidos para uma membrana de PVDF. O bloqueio foi realizado em leite seco sem gordura a 5% em solução salina tamponada com Tris (TBS) contendo 0,1% de Tween 20 por 1 h à temperatura ambiente. A membrana foi incubada com anticorpo primário anti-decorina de coelho (diluído 1: 200; Boster, Wuhan, China) (diluído 1: 200; Bioss, Pequim, China) durante a noite a 4 ° C e reagiu nos segundo dias; com anticorpo secundário (imunoglobulina G-BOAT (diluição de 1: 40.000) combinada com peroxidase de rábano silvestre (Boster, Wuhan, China) por 1 hora à temperatura ambiente. Os sinais de Western blot foram detectados pelo aumento da quimioluminescência na membrana quimioluminescente após irradiação de raios-X. Para análises densitométricas, as manchas foram digitalizadas e quantificadas usando o software BandScan e os resultados foram expressos como a proporção de imunorreatividade do gene alvo e imunorreatividade da tubulina.
Os cálculos estatísticos foram realizados usando o pacote de software SPSS16.0 (SPSS, EUA). Os dados coletados durante o estudo foram expressos como média ± desvio padrão (média ± DP) e analisados ​​usando medidas repetidas de uma via Análise de variância (ANOVA) para determinar as diferenças entre os dois grupos. P <0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
Assim, o estabelecimento de um modelo animal de MC implantando NPs autólogos no corpo vertebral e realizando observação macroanatômica, análise de ressonância magnética, avaliação histológica e análise biológica molecular pode se tornar uma ferramenta importante para avaliar e entender os mecanismos do MC humano e desenvolver nova terapêutica intervenções.
Como citar este artigo: Han, C. et al. Um modelo animal de alterações módicas foi estabelecida implantando o núcleo autólogo pulposo no osso subcondral da coluna lombar. Sci. Rep. 6, 35102: 10.1038/srep35102 (2016).
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Hora de postagem: dez-13-2024